一种用于甲基安非他命检测的方法及生物传感器与流程

本发明属于环境检测技术领域，具体涉及一种污水中和环境水体中甲基安非他命的检测技术。

背景技术：

根据2015年世界毒品报告和其他相关文献，非法药品在全世界正在令人担忧的大规模的生产和滥用。在这些众多的非法药品中，在全球范围内，甲基安非他命(也叫甲基苯丙胺、冰毒)是仅次于大麻的最广泛的滥用毒品。由于其日益增长的滥用，给人类的健康带来了巨大的威胁，因为具有神经毒性的甲基安非他命对人的中枢神经系统具有不可恢复的损伤作用。如果能够简单、快速且价格低廉的对甲基安非他命进行检测，也许能在某种程度上有效的阻止其滥用，但是目前并没有这样一个有效的检测方法。

在现有技术中，存在一些针对头发、血液、尿样以及废水等样品中的甲基安非他命检测的方法，包括气质联用、液质连用、动态离子色谱、成像质谱、表面增强拉曼和微流控装置等等。虽然这些技术具有很高的灵敏度和好的选择性，但是他们要求复杂的样品准备和前处理技术、昂贵的设备仪器、以及专业技术人员。而在实际应用中，有时为了判断嫌疑人是否吸毒，需要快速的得到检测结果甚至需要现场检测以阻止毒品滥用，但是上面提到的这些方法都无法实现现场快速检测。因此，如何简单、快速地进行甲基安非他命的检测及提供一个便携式的检测工具，能够让非专业人员在现场利用较少的样品也能够精确的、快速的检测到体液和环境水体中低含量的甲基安非他命，比如对血液和尿样的检测用来判断嫌疑人是否吸毒，这是本领域技术人员急需解决的技术问题。

技术实现要素：

为解决现有技术中的上述问题，本发明提出一种简单、便捷的甲基安非他命(甲基苯丙胺)检测方法，以及用于实现该检测方法的生物传感器。

一种甲基安非他命的检测方法，包括如下步骤：

将DNA酶分子信标和甲基安非他命适配体各自在第一设定温度下解离一第一预定时间后冷却到室温；

将DNA酶分子信标和甲基安非他命适配体混合在HEPES缓冲溶液里形成混合液，并在第二设定温度下温育一第二预定时间；

将待测对象加入到混合液中，再在第三设定温度下温育一第三预定时间；

将氯高铁血红素加入到混合液中；

将比色物质加入到混合液中，在室温下反应后根据显色确定待测对象中是否含有甲基安非他命。

一种用于甲基安非他命检测的生物传感器，包括以下部分

由DNA酶分子信标和甲基安非他命适配体混合在HEPES缓冲溶液里形成的双链DNA；

氯高铁血红素；

由ABTS和双氧水混合形成的比色物质。

进一步的优选方案，DNA酶分子信标中碱基对数量为37，比色物质为ABTS和双氧水，ABTS作为比色基底，其能够被双氧水催化氧化成有颜色的ABTS⁺。双链DNA由以下方式制成：将DNA酶分子信标和甲基安非他命适配体各自在设定温度下解离一预定时间后冷却到室温；将DNA酶分子信标和甲基安非他命适配体各自在第一设定温度下解离一第一预定时间后冷却到室温；将DNA酶分子信标和甲基安非他命适配体混合在HEPES缓冲溶液里形成混合液，并在第二设定温度下温育一第二预定时间，以形成双链DNA。第一设定温度为90℃，第二、第三设定温度为37℃；第一预定时间为5分钟，第二预定时间为30分钟，第三预定时间为90分钟。

通过上述技术方案，本发明实现了简单、快速、便捷的甲基安非他命的检测，具有灵敏度高、不受其他物质干扰的优点。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

【附图说明】

图1甲基安非他命的检测机理

图2 DNA酶分子信标中碱基对的优化

图3比色基底的选择

图4比色信号强度与甲基安非他命浓度的关系

图5裸眼看到的比色信号强度与甲基安非他命浓度的关系

图6干扰试验结果

【具体实施方式】

下面就本发明的具体实施方式作进一步介绍。

生物传感器是一个具有生物受体并且在目标分析物出现还能产生特定信号(如电化学、光学、纳米机理及质量敏感信号等)的小型装置，具有价格低廉、响应快速和容易跟其他设备整合的优点。生物传感器作为一种有效的检测工具，已经在健康和环境监测中有广泛的应用，能够用于检测重金属离子、小分子、目标DNA、多肽、酶、蛋白质、生物标记物、甚至细菌。生物传感器在分析体液和环境中的样品时，具有很大的潜力，与传统的分析方法相比，生物传感器的优势可以使其能够实现便携式、小型化，以及可用于量少且成分复杂的样品的分析。

在现有技术中，利用DNA酶作为一种催化信标来设计的生物传感器由于其具有高特异性而受到广泛的关注。不仅如此，这类生物传感器在环境和复杂样品中还具有让人满意的灵敏度。DNA酶是一类具有催化活性能够催化化学反应的一段DNA分子，其具有高化学稳定性、低成本、合成简单和容易修饰等特点，DNA酶优于蛋白质酶。一个重要且日益受到关注的一种DNA酶叫G四联体-氯高铁血红素复合物，其具有过氧化物酶活性，被成功的应用到蛋白质和DNA，小分子和金属离子的分析检测中。虽然许多研究者确认了这种G四联体-氯高铁血红素复合物具有催化活性，但是需要更多的注意力去关注和发展这种催化信标。

实施例一检测甲基安非他命的检测方法

如图1所示为甲基安非他命的检测机理：具有过氧化物酶活性的DNA酶的活性部位主要由两条分开的链构成：5′-AGG GAC GGG-3′和5′-GTGGAGGGT-3′(图1中较长链的两头浅色部分，即两条链相交点之上和之下的部分)，除了这两条链以外，DNA酶分子信标还包括一段寡聚核苷酸(图1中较长链中间的黑色部分，即两条链相交点之间的部分)，它位于两条催化活性链的之间。这段寡聚核苷酸通过碱基互补配对原则可部分的与甲基安非他命适配体互补形成双链DNA。分析过程中，DNA酶分子信标本身由于在氯高铁血红素存在下能够形成G四联体-氯高铁血红素结构的DNA酶，这种酶具有过氧化物酶活性。但是当DNA酶分子信标与甲基安非他命适配体杂交形成杂交DNA双链的后，这种DNA酶分子信标不具有过氧化物酶的活性。甲基安非他命由于能跟甲基安非他命适配体特异性的结合从而可以导致DNA酶分子信标从杂交后的DNA双链上解离下来。也就是说，甲基安非他命在这个过程可以导致DNA酶分子信标的催化活性恢复，恢复活性后的DNA酶分子信标能够催化氧化一个显色的比色反应，这个显色反应的强度可以反应甲基安非他命的浓度。通过这个特殊的信号响应，可以设计这种G四联体-氯高铁血红素DNA酶分子信标探针用于检测甲基安非他命。

基于上述原理，本发明的甲基安非他命检测的步骤如下：

步骤一，将DNA酶分子信标和甲基安非他命适配体各自在第一设定温度下解离一第一预定时间后冷却到室温；

其中DNA酶分子信标可以采用上海生工，纯化方式为色谱纯的氯高铁血红素，而DNA酶分子信标中碱基对数量为37。

通过实验发现，DNA酶分子信标的长度，即碱基对数量不同对其催化活性有很大的影响。一方面是因为G四联体结构的形成受链长的影响；另一方面是因为DNA酶分子信标和甲基安非他命适配体形成的双链的稳定性是由碱基对决定的。配对的碱基对太多会使得甲基安非他命适配体从双链DNA上解离困难，但是太少的碱基配对数不能阻止双链DNA中DNA酶分子信标形成有酶活性的G四联体-氯高铁血红素复合物。如图2所示，3条不同长度的DNA酶分子信标应用在实验中以选择最佳长度，其中DNA酶分子信标1-3的碱基对数量分别为57、47和37。通过实验发现，在没有甲基安非他命适配体的情况下，3条DNA酶分子信标都可以使415纳米处紫外-可见吸收增强。但是加入DNA酶分子信标2的体系信号最强。这说明，DNA酶分子信标2的碱基数最有利于形成G四联体结构。但是甲基安非他命适配体从双链DNA上的解离也要考虑，在加入甲基安非他命适配体和甲基安非他命的情况下，实验发现加入DNA酶分子信标3的溶液具有最大的紫外-可见吸收强度，这说明较少的碱基配对数更有利于甲基安非他命适配体从双链DNA上解离然后形成甲基安非他命-适配体复合物。综合考虑，DNA酶分子信标3，即碱基对数量为37，作为最佳DNA酶分子信标用于甲基安非他命的检测。

步骤二，将DNA酶分子信标和甲基安非他命适配体混合在HEPES缓冲溶液里形成混合液，并在第二设定温度下温育一第二预定时间；

DNA酶分子信标本身由于在氯高铁血红素存在下能够形成G四联体-氯高铁血红素结构的DNA酶，这种酶具有过氧化物酶活性。但是当DNA酶分子信标与甲基安非他命适配体杂交形成杂交DNA双链的后，这种DNA酶分子信标不具有过氧化物酶的活性。

步骤三，将待测对象加入到混合液中，再在第三设定温度下温育一第三预定时间；

将可能含有甲基安非他命的待测对象，如嫌疑人员的血液、尿样等液体，加入到混合溶液中，甲基安非他命由于能跟甲基安非他命适配体特异性的结合从而可以导致DNA酶分子信标从杂交后的DNA双链上解离下来。也就是说，甲基安非他命在这个过程可以导致DNA酶分子信标的催化活性恢复。

步骤四：将氯高铁血红素加入到混合液中；

步骤五，将比色物质加入到混合液中，根据显色确定待测对象中是否含有甲基安非他命。

设计G四联体-氯高铁血红素DNA酶传感器的另外重要一点是比色基底的选择。常用的还原基底是一种叫做ABTS的化合物。这种物质在过氧化物酶的存在下，能够被双氧水催化氧化成有颜色的ABTS^·+。这种物质在波长415纳米处具有显著的紫外-可见吸收信号。因此，选择ABTS作为比色基底。

如图3所示为比色基底的选择：在实验中，首先选择不同浓度的双氧水分别在有和没有氯高铁血红素的情况下，查看其对ABTS的影响。实验结果表明，加入双氧水的体系跟没有加入双氧水的体系，紫外吸收信号差别并不明显；加入不同浓度的双氧水之间的紫外吸收信号差别也不明显。也就是说双氧水并不能使ABTS发生显色反应。并且，加入氯高铁血红素后，溶液中ABTS的信号也没有增强。这些结果说明单纯的双氧水和氯高铁血红素并不能使ABTS氧化而发生显色反应。但是，当有DNA酶分子信标存在的条件下，415纳米处的信号强度显著增强(图3中的MB)；当加入一定浓度的甲基安非他命的适配体后，信号强度会急剧下降(图3中的MB+Apt)；然后接着加入甲基安非他命后，信号强度恢复，恢复效率达到82％(图3中的MB+Apt+METH)。分析其原因，一方面甲基安非他命适配体可以与DNA酶分子信标通过碱基互补配对进行部分键和形成双链。另一方面，甲基安非他命适配体可以与甲基安非他命进行特异性结合形成甲基安非他命-适配体复合物。换句话说，甲基安非他命与DNA酶分子信标竞争性的与甲基安非他命适配体结合。当甲基安非他命加入到均相溶液体系后DNA酶分子信标可以特异性的与甲基安非他命适配体结合，从而使得适配体从双链DNA解离，也就使得DNA酶分子信标变成单链，可以形成具有过氧化物酶活性的G四联体-氯高铁血红素复合物结构。从而使得ABTS被催化氧化成ABTS^·+，紫外可见吸收信号在波长415纳米处显著增强。

实施例二用于检测甲基安非他命的生物传感器

根据上述检测甲基安非他命机理，本申请还设计了一个基于比色分析的甲基安非他命的生物传感器，这种传感器简单快速并且不需要复杂或者昂贵的仪器设备。

该用于检测甲基安非他命的生物传感器包括：

由DNA酶分子信标和甲基安非他命适配体混合在HEPES缓冲溶液里形成的双链DNA；

氯高铁血红素；

由ABTS和双氧水混合形成的比色物质。

其中双链DNA由以下方式制成：将DNA酶分子信标和甲基安非他命适配体各自在第一设定温度下解离一第一预定时间后冷却到室温；将DNA酶分子信标和甲基安非他命适配体混合在HEPES缓冲溶液里形成混合液，并在第二设定温度下温育一第二预定时间，以形成双链DNA。

采用本发明的甲基安非他命检测方法和生物传感器进行测定的一实例如下：

DNA酶分子信标(10μM)和甲基安非他命适配体(10μM)各自在90℃下解离5分钟然后缓慢冷却到室温。20μL的10μM DNA酶分子信标和20μL的10μM甲基安非他命适配体混合在HEPES缓冲溶液里，并温育在37℃下半个小时，然后甲基安非他命和10μL的5μM氯高铁血红素加入到混合液中，并加入缓冲液使其最终体积160μL，然后在37℃下温育一个小时，然后20μL 7.2mM ABTS和20μL H₂O₂(15‰，v/v)加入到混合液中。然后混合物混匀后在室温下反应10分钟，然后在室温下进行比色测定。

如图4所示，本发明成功的设计了一个新的、简单的，灵敏的甲基安非他命检测方法。DNA酶分子信标/甲基安非他命适配体浓度为1uM的情况下，安非他命浓度在0-1000nM范围内，随着浓度的升高，吸收信号变强。附图4表明在波长为415纳米的信号强度跟甲基安非他命的浓度在8nM-500nM具有很好的线性关系线性相关系数R²为0.991，根据三倍标准偏差规则，检测限为0.5nM。不仅如此，通过实验还发现，如果对甲基安非他命浓度取对数，对数浓度与相应的吸收信号强度也具有线性关系，线性范围为0.5nM-200，相关系数为R₂²＝0.983(Fig.S3，seen in the Supporting Information)。更加显著地是，不同浓度的甲基安非他命加入到检测体系中(blank，0.50nM，1.00nM，5.00nM，10.00nM，50.00nM，100.00nM，200.00nM，500.00nM，and 1000.00nM)，可以用裸眼显著的看到其颜色的变化梯度，如图5所示。与现有技术中其他甲基安非他命检测方法相比，这个方法具有让人满意的灵敏度及其独特的优势。另外，所提出方案的甲基安非他命的检测方法的检出限远远低于美国国家毒品管理机构推荐的1000ng/ml(6.7μM)。

为了测定该方法的特异性，利用其他毒品进行一系列的干扰试验。这些毒品包括美沙酮，可卡因，mephedrone，卡西酮，甲卡西酮，BZP，TFMPP，MDPV，(1)-MDA，MDMA，EDDP和m-CPP(1000ppb)。图6中从左到右依次是METH、KET、NK、MOR、MTD、COC、MEP、MDMA、CAT、MCAT、BZP、TFMPP、MDPV、MDA、EDDP、m-CPP、空白样品的检测结果，由图6可知，在甲基安非他命的存在下，吸收信号显著增强，而加入的其他毒品后，吸收信号却相当低，与空白样品相比没有什么变化。这表明，即使在其它高浓度物质的干扰下，该方法对甲基安非他命的检测几乎不受到其他物质的干扰，具有显著的特异性。这主要是由于甲基安非他命适配体对甲基安非他命具有很强的特异性结合作用。

为了研究该方法在实际样品中的应用潜能，该方法应用到尿样中甲基安非他命的检测。吸毒人员的尿样来源于公安部禁毒局。所有的尿样需用0.22μm滤膜过滤。首先进行加标回收率计算，不同浓度的甲基安非他命加入到一定体积的尿样中(最终浓度为50，100and 200ppb)。根据下表1，甲基安非他命加标回收率取得令人满意的效果，回收率大于85％。另外，HPLC-MS用于尿样中甲基安非他命的检测，以对比新设计探针的准确性。从测得的结果表明，液质连用仪器测得的尿样浓度跟新设计的浓度一致。因此，本发明的检测方法具有巨大的潜力应用于实际样品中的甲基安非他命的检测。

表1.水样中METH的加标回收率(50.0，100.0and 200.0g L^-1)

综上所述，本发明成功的构建了一个简单，成本低廉的，免标记的高选择性和高灵敏度的生物传感器。该生物传感器是基于G四联体-氯高铁血红素DNA酶分子信标来构建的甲基安非他命检测方法。该方法的检测限为0.5nM，线性范围为8-500nM。此外，其他毒品的存在对甲基安非他命的检测没有干扰，具有很高的特异性。最后，我们利用所设计的方法用于尿样中甲基安非他命的检测，加标回收率超过85％。不仅如此，利用该方法测定的5个尿样中的甲基安非他命的浓度与HPLC-MS测定的结果一致。这表明G四联体-氯高铁血红素复合物结构的DNA酶分子信标探针具有很大的潜力应用于实际样品中的甲基安非他命检测。并且值得注意的是，这种DNA酶分子信标探针只需要改变部分碱基和对应的适配体就有可能应用到其他目标物的检测。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。