生物需氧量传感器的制作方法

本申请是国际申请日为2012年06月14日、申请号为201280034071.2(PCT/US2012/042501)、发明名称为“生物需氧量传感器”的分案申请。

本申请要求2011年6月14日提交的美国临时申请号61/496,608的权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。

发明领域

本发明涉及生物需氧量(BOD)传感器。BOD传感器可以用于(例如)监测水中有机污染物。

背景

生物需氧量(BOD)是流体(通常是水)中需氧生物有机体所需用以分解存在的有机物质的溶解氧量。BOD通常被表示为给定流体样本在给定温度下、在给定时间段上所需要的氧量。由于BOD涉及生物活性，因此所引用的BOD值并非很精确，但它给出了对流体中有机质含量的良好指示。

BOD测量最常用于监测水的有机质含量，例如，废水、工业过程水、农业过程水、农业径流、地表水的有机质含量。尽管水中的有机物可能来自多种“天然”来源，例如，水生植物或者落叶，但是水中的有机物最经常源自动物粪便或使用化学品的工业过程中的污染。有机污染还可以包括(例如)食品加工废料、碳氢化合物、个人护理产品或杀虫剂。因此，测量水的BOD给出水清洁度和其可饮用性的一般含义。如挥发性脂肪酸(VFA)的一些有机化合物仅与动物粪便相关联并且发出可能存在危险微生物(例如，霍乱)的信号。要求定期监测水质的大多数机构会测量BOD以及悬浮固体和氨含量。

用于在废水处理过程和工业中监测BOD的当前实践要求BOD₅测试，其以获得结果所需的五天而命名。由于它的实施需要五天，因此在采集样本与获取BOD测量结果之间存在显著延迟，从而使得不可能进行实时监测。另外，BOD₅测试的准确度可疑并且具有非再现性，同时耗时耗力。参见DiLorenzo等，Water Research，43(2009)3145-3154，其以引用方式整体并入本文。

因此，人们极大地关注用于BOD监测的改进的实时传感器。这些传感器将通过允许开发条件进行更快速的调整、同时降低成本来大大益于综合水管理方法。理想的传感器是廉价、稳健、准确的，并且具有传感器所有效的大范围的样本浓度。

概述

本发明提供改进的BOD传感器，所述BOD传感器尤其适用于监测工艺废水、工业过程水以及农业过程水的质量。本发明包括：传感器；包括所述传感器的系统；使用所述传感器来测量BOD的方法；以及与本发明的所述系统一起使用的稀释液。所述传感器优于先前BOD传感器之处在于它们廉价、稳健、对BOD变化响应迅速并且能够检测大范围的BOD。

本发明包括生物需氧量(BOD)传感器，其并有至少三个工作电极、至少一个反电极、稀释液储槽以及用于测量从所述工作电极流至所述反电极的电流或电压的传感器。所述BOD传感器通常也将包括至少一种安置在所述工作电极附近的电活性微生物。本发明的BOD传感器可以另外包括接收将监测BOD的样本的混合腔室，其中所述样本经过稀释以制成至少三个不同稀释物，测量所有所述至少三个不同稀释物的BOD。通过对至少三个样本测量BOD，可能快速确定BOD值，同时仍然保持测量大范围的BOD值的能力。在本发明的一些实施方案中，电压来源可操作地连接在所述工作电极与所述反电极之间。

本发明包括用于确定样本生物需氧量(BOD)的方法，所述方法包括：用稀释液稀释所述样本以获得所述样本的至少三个不同稀释物；使用生物电化系统(BES)测量所述至少三个不同稀释物的每个的BOD以获得至少三个BOD值；以及比较所述至少三个BOD值以确定所述样本的BOD。测量程序通常将使来自BES的电流或电压测量结果与BOD值相关联，例如，通过参照BES的校准曲线进行所述关联。在一个实施方案中，所述方法在1小时内完成。

本发明包括用于测定目标有机化合物的存在的另一类型的传感器。这种传感器包括：第一电极和第二电极；可操作地连接至所述第一电极和第二电极上的电压来源；可操作地连接至所述第一电极和第二电极并能测量所述第一电极与第二电极之间的电流的电流传感器；以及产电细菌的培养物，其代谢式使用有机物质作为电子供体的能力大致上限于目标有机化合物。在一个实施方案中，这种传感器另外包括用于所述第一电极和第二电极的壳体，其中所述壳体限制所述第一电 极或所述第二电极附近的有氧代谢。所述传感器可使用如硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)的产电细菌。这种传感器将极适用于测量如在城市废水和厌氧消化器中所见的挥发性脂肪酸。

本发明另外包括使用一个或多个电极对的生物电化系统(BES)，所述生物电化系统能实时感测并且监测BOD，包括VFA和其它复杂有机物。所述系统可将单电极对用作传感器来操作，或者将多电极对用作传感器阵列来操作。在使用多个BES的情况下，它们可以能够使用通常用缓冲过的稀释液制备的一系列稀释物来鉴别实现亚饱和条件的最小稀释度。这种方法使传感器响应时间最少，因为它使用了瞬时电流作为信号。这种方法还会避免pH值和盐度问题，因为样本经过缓冲。此外，所述一系列稀释物确保至少一个传感器在大多数情况下不饱和并且所述传感器将无需校准即在较长周期内具有较大的准确度。

本发明还包括一种用于测量流体需氧量的系统，所述系统包括：生物电化系统(BES)；连接至样本的稀释溶液混合系统；可操作地连接至所述BES的电流或电压传感器；以及控制电子器件，其可操作地连接至所述电流或电压传感器和缓冲液注射系统上，并且能从所述电流或电压传感器接收测量结果并使所述缓冲液混合系统以缓冲液接触所述样本。

附图简述

图1描绘示例微生物燃料电池。

图2是本发明的生物需氧量传感器的一个实施方案的示意图。

图3A描绘用于BOD传感器的生物电化系统的一个实施方案。

图3B描绘用于BOD传感器的生物电化系统的一个实施方案。

图4A描绘用于VFA传感器的生物电化系统的一个实施方案。

图4B描绘用于VFA传感器的生物电化系统的一个实施方案。

图5示出用于确定BOD传感器的有效操作范围的稀释曲线。

图6示出BOD与BOD传感器的电流之间的关联。

详述

本发明提供用于测量流体(例如，水)的生物需氧量(BOD)的传感器、系统以及方法。所述传感器是迅速、廉价、稳健的并对测量样本中的BOD而言具有大动态范围。所述传感器将允许针对包括废水处理、工业过程水处理、农业过程水 处理和地表水监测的多种应用进行实时BOD测量。

生物电化系统(BES)

本发明的BOD传感器基于如微生物燃料电池的生物电化系统(BES)。BES是一种新型装置，其使用电活性微生物(通常可互换地称作光电分子、产电微生物(electrogen)或产电菌群(exoelectrogen))以在燃料电池(阳极、阴极、可穿透的屏障)或准燃料电池(两个电极)、架构中产电。通常，电活性微生物需要营养素或基质(例如，化学物种)来完成某些代谢过程。在这种代谢过程中，电活性微生物将会将电子供至电路的电极或从电路接收电子，从而使电路内的电位或电流发生可测量的变化。由于BES可以将各种范围的有机物用作营养素，因此BES输出将会随着BOD加载率以及有机营养素的类型而变化。

本发明提供多个BES布置，所述多个BES布置能够检测并且测量包括VFA的总BOD或仅测量VFA，其通过测定电化学活性微生物群落的代谢活动所产生的电流来实现。通常，在存在充当催化剂的光电分子时，有机材料在一个电极(例如，阳极)处氧化。在这种布置中，电子从阳极流至第二电极(例如，阴极)，从而产生电流。所述电流可以直接测量，或它可以通过电阻测量为电位。

已经使用微生物燃料电池(MFC)、即一种类型的BES来报道生物需氧量(BOD)的浓度。示例微生物燃料电池(MFC)在图1中示出。MFC包括：两个电极，即阳极和阴极；电活性微生物；选择性膜，例如，质子可穿透膜；以及连接阳极和阴极的电路。在MFC的阳极侧，微生物使用水来进行有机物质代谢以产生二氧化碳和质子。在这个过程中，产生电子(e^-)，所述电子被供至电极(例如，阳极)。如图1所示，所供给的电子可以通过电路行进到达另一电极(例如，阴极)，其中将电子供至氧以产生水。然而，如在本领域中已知，可得使用多种物种的许多阴极布置。阴极例如可以暴露于空气中。如图1所示，质子可以行进通过半穿透膜以与流过电路的电子一起平衡电荷。

如图1所示，由于存在由微生物代谢的营养素(或基质)，因此MFC可以产生电流。令人惊讶的是，由于代谢，因此多种微生物都能将电子供至电极。营养素可以是有机化合物(糖、碳水化合物、小的有机酸)或硝酸盐，或者更外来的物质。在下文中更详细地讨论特定微生物。在图1所示的示例MFC中，当存在有机物质、并且条件正确时，电极之间产生电流。然而，通过在MFC暴露于具有不同水平的所需营养素的不同流体培养基时测量电流或电位，可以利用相同代谢过程来产生传感器。或者，可以用外部电源(未示出)和监测以确定代谢活动何时 发生并因此与营养素的存在相关联的电位偏置图1所示的电池布置。在一些实施方案中，无需选择性膜就可执行感测。

使用图1中公开的MFC在实际应用上存在多个挑战。确切地说，对于在线工业应用，MFC传感器具有以下问题：(1)无法提供短的响应时间和大的动态范围两者；(2)低再现性和稳定性；以及(3)所测量的BOD随着有机质组成而有大的变化。参见Kim等，Biotechnology Letters，25(2003)541-545，其以引用方式整体并入本文。

所公开的本发明已经大致上解决了上文所指出的问题。也就是说，本发明的传感器、系统和方法提供一种具有迅速响应和大的动态范围的BOD传感器，其中值是可再现的并稳定的。如图2中所公开，本发明是通过提供多个并联BES传感器来解决响应时间和动态范围的问题，所述多个并联BES传感器各自监测样本的分别稀释过的流的BOD。

图2呈现本发明的一个实施方案，然而，组件的替代性布置(例如，电池数量、电测量类型)将对本领域的技术人员显而易见。如图2所示，传感器系统包括多个BES电池、缓冲液槽(稀释液储槽)、泵(例如，蠕动泵)、电阻箱和万用表或能测量电压和/或电流的其它传感器。在一个实施方案中，每个BES电池大致上相同。在测量期间，每个电池接收一些量的样本，并且在每个电池中测量电流或电压以确定BOD值。在一些实施方案中，一个电池将接收未稀释的样本，而其余电池将接收可替代地稀释过的样本。可如下制备稀释物：使稀释液(缓冲液)以恒定速率连续地流入每个电池中并且计量样本的量以产生样本的替代浓度。或者，稀释物可通过将不同量的稀释液与相同量的样本混合(接触)来产生。或者，可以连续稀释第一稀释物以产生一系列稀释过的样本。

稀释液可以是与微生物和电极都相容的任何流体。稀释液将优选地具有比样本(例如，由具有足够高盐度的缓冲盐溶液组成的稀释液)大的离子强度(导电性)。稀释液通常将用弱酸或弱碱缓冲并且含有合适反离子以在样本性质波动时维持缓冲条件。在一个实施方案中，稀释液的导电性是至少约20毫西门子，例如，至少约50毫西门子，例如，至少约100毫西门子，例如，至少约200毫西门子，例如，至少约500毫西门子。稀释液还可含有保持微生物最佳地起作用所需的营养素，例如，糖、氨基酸、电解质、氮源、磷源、硫源。

由本发明的系统分析的样本可以来自如在背景部分中概述的多个过程中的任何过程。另外，整个样本可以在其引入本发明的系统之前进行稀释，在所述系 统中，它将经受进一步的稀释。尽管图2公开了泵，但是另外可能的是，泵由操作人员的行动所替代，所述操作人员制备样本的独立稀释物并将样本引入多个电池，从而确定BOD。

如在下文更详细地讨论，每个BES电池将在操作之前进行校准，以使给定电流或电压可与给定BOD水平相关联。BES响应可以通过更改电池大小/形状、电极大小/形状、流动速率或电池的微生物密度而进行修改。因此，可能调整每个BES电池以实现电流(或电位)可与BOD水平相关联的有益线性范围。另外，由于针对给定BOD水平来调整每个电池以实现更好性能，因此系统的动态范围可以通过包括并联操作的具有不同性质的多个电池来变大。由于每个电池将以线性模式操作，因此响应性将也是高的。也就是说，BOD水平的变化将快速导致至少一个BES的所测量的电流(或电位)的变化，从而允许快速识别BOD的变化。因此，传感器将允许实时监测BOD。

尽管未在图2中示出，但是本发明的系统可以包括将从万用表接收例如每个BES电池的值的处理器。处理器将来自万用表的值与之前对每个BES电池测量的BOD与电流/电位之间的相关性进行比较，并且对BOD值赋值。在一个实施方案中，处理器可简单地将计算出的BOD值输出至例如显示器。在一个实施方案中，处理器将确定所测量的电流/电位是否在线性范围外(例如，低于测量阈值或者饱和)并输出所述电池的空值(例如，NV、Err、N/A等)。在一个实施方案中，处理器将仅输出所具有的电流/电位测量结果在线性范围内的一个或多个电池的BOD值。在一个实施方案中，处理器将对所具有的电流/电位测量结果在线性范围内的一个或多个电池的测量值求平均值，并且随后将平均值输出。处理器还可以使用一个或多个电池的变化速率信息来确定BOD水平已经发生变化，并且因此重新开始测量算法。

尽管图2中显示的是万用表，但技术人员将能够使用多个电流或电位(例如，电压)传感器中的任何传感器来测量BES电池电性质的变化。例如，传感器可包括电压计、电流计、静电计、电阻计或电位计。也构想出测量电流或电位的非传统的方法，例如，测量响应于电流增大的电阻系统的温度变化，或者测量从系统接收电流的LED亮度。

在图2所示的实施方案中，传感器阵列系统含有五个相同电池。各个电池共享公共缓冲溶液供应槽，但含有它自己的阳极和阴极腔室。电流与每个电池的BOD的线性关系将在五个电池并联工作之前证实并且确认。每个电池的供料将 为具有固定流动速率的缓冲溶液与具有不同流动速率的样本的混合物以制成各种稀释物。缓冲溶液与样本的混合物将被连续泵送至每个电池中。泵送至每个电池中的样本量将由流动速率控制，控制方式为使每个电池将含有由预定量的缓冲液稀释的样本。例如，在五电极对系统中，用于电池1、2、3、4、5的流动速率的比可为1:0.5:0.25:0.125:0.075，因此可将样本分别稀释至1、2、4、8、16倍。连续稀释的益处是可以鉴别最小稀释比率以提高准确度。

尽管图2示出了具有它们自己的电极的独立电池，但预期可使用替代性电极布置。例如，两个或更多个BES电池可以共享公共电极，例如公共阴极。电极可由多种材料(金属、塑料等)中的任何材料构造。在一些实施方案中，阳极包括碳纤维、例如碳丝，并且阴极包括不锈钢、例如不锈钢丝线。电极能以任何形状制成，例如、箔形、杆形、方形、钮形等。在一个实施方案中，电极是由网状材料(例如，开孔网(筛状)材料)制成，从而允许流体通过电极。

图3A和图3B中示出BES电池的特定设计。图3A和图3B两者都包括具有内部阳极的流电池室。样本或稀释过的样本将会流入一个端口并从另一端口流出。如图3A和图3B所示，阳极将由碳纤维网构造。图3A中的电池使用空气阴极，而图3B中的电池具有流电池阳极和阴极，这与传统微生物燃料电池设计类似。在图3A和图3B两者中，半穿透膜存在于阳极与阴极之间，然而，在图3A中，膜在外部(暴露于空气中)，而图3B中，膜在内部并且介于两个流电池之间。图3B中的电池可以用含氧流体(例如，含氧水)进行操作，或可通过例如用泵、压缩空气或者一侧的弱真空使空气通过电池而将其用作空气阴极。

施加电流

在本发明的一方面，将电流施加于系统。另一方面，没有将电流未施加于系统。优选施加电位为约0.8V。系统可由单电极对或并联操作的多电极对阵列组成。当将电流施加至系统时，能在缺氧环境中较有效地操作。在氧存在量最小化时，目标物质氧化、尤其是BOD中所用的电子将会存放在电极上。这可改进所产生的信号的准确度。类似原理适用其它可能具有竞争性的电子受体(如硝酸盐)，并且因此，它们各别浓度的最小化将会改进信号的响应性。例如，在进入传感器前的脱氮和/或氮化步骤可以是有利的。

在一个实施方案中，本发明包括两个生物电极，在所述电极之间施加有电压(从而形成了阳极和阴极)。并不需要膜来将电极对分开。在固定的施加电压下，系统中的电流将会随着溶液中的复合有机化合物(如VFA)的浓度而变化。在这个 实施方案中，阳极将氧化醋酸盐和挥发性脂肪酸(VFA)。阴极可以将如CO₂的其它物质还原成甲烷。

在图4A和图4B中示出用作VFA传感器的BES电池的示例实施方案(例如没有膜)。电池可为两个大致并联的电极(图4B)，或者电池可以包括管道，所述电极安置在所述管道内(图4A)。当布置在流管末端时，图4A中描绘的电池提供以下附加益处：大致上允许所有氧都在到达电极之前耗尽。因此，提供缺氧环境，其中较大比例的在有机物的代谢氧化期间所形成的电子将存放到电极。

在第二实施方案中，可以使用控制阴极，从而仅将生物阳极留作为活性剂。如果耗尽，那么可再次填充或者替换这个控制阴极。

细菌

可将大量电活性微生物并入BSE中以实现所需的响应和敏感性。一般来说，电活性微生物是选自下属的物种：芽孢杆菌属(Bacillus)、地杆菌属(Geobacter)、希瓦氏菌属(Shewanella)、梭状菌属(Clostridia)、假单细胞菌属(Pseudomonas)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、脱硫单胞菌属(Desulfuromonas)、脱硫球茎菌属(Desulfobulbus)、红育菌属(Rhodoferax)或埃希氏菌属(Escherichia)。微生物物种的组合也可用于本发明的系统、传感器和方法。通过选择电活性微生物的所需特性或者鼓励自然选择优势微生物，可以开发对某些化学物质(例如，VFA)特定的BES。另外，最适于如有机化合物的水解、发酵或者氧化的某些过程条件的微生物可以用于栖息于BES中。因此，稳健的化学传感器将会具有各种微生物，它们各自在代谢特定化合物或化合物集中起到作用。例如，已经示出硫还原地杆菌对VFA进行活性代谢，尤其是在可接收过程中产生的电子的金属的存在下。

本发明涵盖在一个或多个电池中具有电活性微生物的混合培养物或具有多个电池，其中每个电池具有独立或不同的微生物群落的BES。可以使用具有电池阵列(各自具有独立微生物群落)的传感器，例如以对样本执行多重分析，例如同时测量BOD和其它物质(例如，硝酸盐)，或以分别测量BOD和它的组分部分，例如VFA和碳氢化合物。

控制特定性

为了检测并监测VFA和其它特定有机物，本发明可使用以其受限的代谢多样性为特征的产电微生物群落的纯培养物或大致上纯培养物。在过程条件取决于特定副产品的产生的情况下或在用户有义务来报道超过BOD测量结果的物质水平的情况下，这些控制器将是有用的。受限的代谢多样性使得产电菌群能够仅使 用目标用作电子供体的物质。优选的微生物群落将能仅使用醋酸盐或氢作为电子供体，如硫还原地杆菌分离菌。硫还原地杆菌的代谢不灵活性类似于通常使用醋酸盐或氢作为电子供体并使用二氧化碳作为碳源的其它产甲烷的微生物物种的代谢不灵活性。因此，硫还原地杆菌可以成为用于特定物质(例如，VFA)的传感器的基础，如在下文所讨论。当然，还可使用其它物种或混合产电群落来开发系统，所述其它物种或混合产电群落已经最优化以使每个组分物种的代谢特征指示废料流中存在的挥发性脂肪酸的相对浓度。

采用如硫还原地杆菌的特定微生物群落的传感器可以得到校准并且用于控制特定过程，例如，厌氧消化器。信号可与厌氧消化活动模拟模型进行比较。这个模型可以包括随着各种参数(例如，温度、pH值、盐度)而变化的预期VFA浓度以及特定失效模式两者。生物电化信号还可用于过程控制系统，从而最优化系统性能并在早期阶段突显潜在的系统不平衡性。醋酸和另外VFA的高浓度或低浓度(指示系统不平衡性)将会快速检测出来，并且将会调整系统控制器以消除反应器不稳定性的威胁。生物电化系统可以部署在流入物/流出物端口处以及整个厌氧反应器自身的内部。每个传感器产生的信号还可用于预测最佳系统参数，包括消化器的水力停留时间、化学需氧量加载率、温度或pH值。

BOD的校准和测量

无论BOD检测系统的布置或用于栖息于传感器中的细菌的培养物如何，电池都将必须在成为BOD传感器的基础之前进行校准或以其它方式表征。如图5和图6所示，将测量电池所产生的电流并将其与在所述电池的稀释水平下以各种BOD水平产生的电流的已知值进行比较。首先，如图5所示，将确定用于所述电池的准确BOD分析的最小稀释比率。换句话说，在小于最小稀释比率的稀释比率下，电池可以饱和，并且相应电流测量结果的精确度小于线性区域中的例如在大于最小稀释比率的稀释度下的电流测量结果。

确定最小稀释比率之后，可以如下校准电池：将电池暴露于多个标准化BOD样本并测量电流以构建相关性，例如，如图6所示。尽管图6将BOD与电流相关联，但也可能将BOD与例如具有已知值的电阻上的电位相关联。图6所示的相关性可以被编程到用于本发明的系统的处理器中，或者操作人员可以使用相关性解释来自万用表测量结果的BOD值。相关性系可表现为数学相关性，或可将它准备在“查阅”表中，在所述表中，假定点间的值在校准点间的值之间是近似线性的。

在对每个电池校准对应电流等的BOD值之后，可将电池并入本发明的系统中。由于可将每个电池容易地鉴别为在它的关联(线性)范围中、或饱和、或低于阈值操作，因此，可以快速并准确地收集有意义的测量结果，所述测量结果对应于至少一个在它的关联范围中操作的传感器。这将允许更宽范围的BOD值，所述BOD值可以得到准确测量并将允许对于测量的更迅速的响应时间。

以引用的方式并入

本公开中已经参考并且引用如专利、专利申请、专利公开、期刊、书籍、论文、网络内容的其它文献。出于所有目的，所有这些文献都以引用的方式整体并入本文。

等效方案

在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明能以其它具体形式来实施。因此，前述实施方案在所有方面都应被视为说明性的，而非是对本文中描述的本发明的限制。因此，本发明的范围由所附权利要求书而非前述描述指示，并且在权利要求书的等效物的含义和范围内的所有变化因此都意图涵盖于其中。