本发明涉及一种中药质量检测方法，特别是一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法。
背景技术：
：益心舒片是由人参、丹参、五味子、黄芪、川芎、麦冬、山楂共六味药组成的中药复方制剂，其中丹参是君药。其具有益气复脉，活血化瘀，养阴生津的功效，用于气阴两虚，心悸脉结代，胸闷不舒、胸痛及冠心病心绞痛见有上述症状者。目前文献报导较多的是益心舒胶囊的质量标准研究，主要集中在鉴别及含量测定方面，而益心舒片的质量标准研究报导较少，并且也是集中在含量测定方面，尚未见有关益心舒片的指纹图谱研究。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种可以更全面的反应药品的信息，更有效地控制益心舒片质量的益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法，其特点是，该方法采用以下方法建立益心舒片皂苷类成分的标准指纹图谱：采用高效液相色谱法，色谱条件与系统适用性试验色谱柱：WatersC18或者kromasilC18，4.6mm×250mm，5μm，以乙腈为流动相A，以水为流动相B；梯度洗脱，0～65min，20％A～65％A；流速0.9～1.2mL·min-1，柱温20～30℃；蒸发光散射检测器条件：蒸发温度100～110℃，载气N2，载气流速2.0～3.0mL·min-1，进样量10μL；理论板数按人参皂苷Rb1计算不低于5000。本发明所述的一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法，其进一步优选的技术方案或技术特征是：流速0.9～1.1mL·min-1，柱温22～28℃。本发明所述的一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法，其进一步优选的技术方案或技术特征是：流速1.0mL·min-1，柱温25℃；蒸发光散射检测器条件：蒸发温度105℃，载气N2，载气流速2.5mL·min-1。本发明所述的一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法，其进一步优选的技术方案或技术特征是：梯度洗脱程序为：0～20min，20％A；20～28min，20～28％A；28～45min，28～36％A；45～50min，36～65％A；50～65min，65％A。本发明所述的一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法，其进一步优选的技术方案或技术特征是：建立益心舒片皂苷类成分标准指纹图谱后，按相同的方法测定待测益心舒片样品的指纹图谱，然后将其与上述益心舒片皂苷类成分的标准指纹图谱比较，相似度不低于0.90。本发明所述的一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法，其进一步优选的技术方案或技术特征是：参照峰溶液的制备：精密称取人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇制成每1mL含人参皂苷Rb1200μg的溶液，摇匀，即得；供试品溶液的制备：取本品，除去包衣，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50mL，密塞，称定重量，超声提取1h，放冷，再称定重量，用水饱和的正丁醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25mL，置分液漏斗中，用等量的氨试液洗涤2次，弃去氨试液，正丁醇液浓缩至干，残渣加甲醇定容于5mL量瓶中，摇匀，离心，取上清液即得；测定法：分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录65分钟的色谱图，即得。本发明所述的一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法，其进一步优选的技术方案或技术特征是：供试品指纹图谱中12个共有峰，以人参皂苷Rb1参照物峰相应的峰为S峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，应符合下表规定：注：计算软件为国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价系统。与现有技术相比，本发明方法的技术效果如下：本发明建立了益心舒片建立了皂苷类成分的HPLC-ELSD的指纹图谱，以人参中的化学成分人参皂苷主要目标，并通过对照品比对及对主要峰进行指认，以全面反映产品信息，更好的控制产品的质量，保证临床疗效。图谱见附录图1益心舒片皂苷类成分HPLC-ELSD标准指纹图谱；图2为延长时间测试滞后峰图谱；图3为十批益心舒片HPLC-ELSD指纹图谱；图4为十批益心舒片HPLC-ELSD对照指纹图谱；图5为益心舒片HPLC-ELSD指纹图谱中各共有峰归属色谱图；图6为益心舒片HPLC-ELSD指纹图谱中色谱峰的对照品定性图；A：混合对照品溶液，B：供试品溶液，图中：1：人参皂苷Rg1，2：人参皂苷Re，4(S)：人参皂苷Rb1，5：人参皂苷Rc，6：黄芪甲苷，7：人参皂苷Rb2，8：人参皂苷Rd，9：五味子醇甲，12：五味子酯甲。具体实施方式以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例1，一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法，该方法采用以下方法建立益心舒片皂苷类成分的标准指纹图谱：采用高效液相色谱法，色谱条件与系统适应性试验色谱柱：WatersC18或者kromasilC18，4.6mm×250mm，5μm，以乙腈为流动相A，以水为流动相B；梯度洗脱，0～65min，20％A～65％A；流速0.9mL·min-1，柱温20℃；蒸发光散射检测器条件：蒸发温度100℃，载气N2，载气流速2.0mL·min-1，进样量10μL；理论板数按人参皂苷Rb1计算不低于5000。实施例2，一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法，该方法采用以下方法建立益心舒片皂苷类成分的标准指纹图谱：采用高效液相色谱法，色谱条件与系统适应性试验色谱柱：WatersC18或者kromasilC18，4.6mm×250mm，5μm，以乙腈为流动相A，以水为流动相B；梯度洗脱，0～65min，20％A～65％A；流速1.2mL·min-1，柱温30℃；蒸发光散射检测器条件：蒸发温度110℃，载气N2，载气流速3.0mL·min-1，进样量10μL；理论板数按人参皂苷Rb1计算不低于5000。实施例3，一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法，该方法采用以下方法建立益心舒片皂苷类成分的标准指纹图谱：采用高效液相色谱法，色谱条件与系统适应性试验色谱柱：WatersC18或者kromasilC18，4.6mm×250mm，5μm，以乙腈为流动相A，以水为流动相B；梯度洗脱，0～65min，20％A～65％A；流速1.1mL·min-1，柱温22℃；蒸发光散射检测器条件：蒸发温度108℃，载气N2，载气流速2.8mL·min-1，进样量10μL；理论板数按人参皂苷Rb1计算不低于5000。实施例4，一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法，该方法采用以下方法建立益心舒片皂苷类成分的标准指纹图谱：采用高效液相色谱法，色谱条件与系统适用性试验色谱柱：WatersC18或者kromasilC18，4.6mm×250mm，5μm，以乙腈为流动相A，以水为流动相B；梯度洗脱，0～65min，20％A～65％A；梯度洗脱程序为：0～20min，20％A；20～28min，20～28％A；28～45min，28～36％A；45～50min，36～65％A；50～65min，65％A；流速1mL·min-1，柱温25℃；蒸发光散射检测器条件：蒸发温度105℃，载气N2，载气流速2.5mL·min-1，进样量10μL；理论板数按人参皂苷Rb1计算不低于5000。实施例5，实施例1-4任何一项所述的一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法：建立益心舒片皂苷类成分标准指纹图谱后，按相同的方法测定待测益心舒片样品的指纹图谱，然后将其与上述益心舒片皂苷类成分的标准指纹图谱比较，相似度不低于0.90。益心舒片皂苷类成分标准指纹图谱参照图1。实施例6，实施例5所述的一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法：参照峰溶液的制备：精密称取人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇制成每1mL含人参皂苷Rb1200μg的溶液，摇匀，即得；供试品溶液的制备：取本品，除去包衣，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50mL，密塞，称定重量，超声提取1h，放冷，再称定重量，用水饱和的正丁醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25mL，置分液漏斗中，用等量的氨试液洗涤2次，弃去氨试液，正丁醇液浓缩至干，残渣加甲醇定容于5mL量瓶中，摇匀，离心，取上清液即得；测定法：分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录65分钟的色谱图，即得。供试品指纹图谱中12个共有峰，以人参皂苷Rb1参照物峰相应的峰为S峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，应符合下表规定：实施例7，一种益心舒片皂苷类成分的指纹图谱检测方法实验：益心舒片由人参、丹参、五味子、黄芪、川芎和麦冬等药味组成，具有益气复脉，活血化瘀，养阴生津的功效，其中人参和丹参是君药，而人参的主要药效成分是人参皂苷，因此为了更好的控制产品质量，保证临床疗效，本文参照中国药典及相关文献，建立了皂苷类成分的HPLC-ELSD的指纹图谱。1.1仪器与试药Aglient1200高效液相色谱仪；蒸发光散射检测器；Agilent1290超高压液相色谱仪，DAD紫外检测器(美国安捷伦公司)；质谱检测器为Agilent6538Q-TOF-MS，电喷雾(ESI)离子源(美国安捷伦公司)，BP211D型电子分析天平(德国Sartorius公司)，Centrifuge5415D高速离心机(德国Eppendorf公司)；Milli-QAcademic纯水机(法国Millipore)；KQ-250DB型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。乙腈(色谱纯，美国天地公司)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。人参皂苷Rb1对照品(批号：110703-201128)，人参皂苷Rd对照品(批号：111818-201302)，人参皂苷Re对照品(批号：110754-201324)，人参皂苷Rf对照品(批号：111719-200703)，人参皂苷Rg1对照品(批号：110703-201529)，人参皂苷Rd对照品(批号：111818-201302)，五味子醇甲对照品(批号：110857-201412，含量以99.4％计)，五味子酯甲对照品(批号111529-200503)，以上对照品均购自中国食品药品检定研究院。人参皂苷Rb2(批号：MUST-15040710)，人参皂苷Rc(批号：MUST-15011912)，均购自成都曼斯特。1.2药品来源本文研究用益心舒片由江苏康缘药业股份有限公司生产。批号分别为：130501、130601、140216、140501、140601、140602、141102、150120、150122、150123。1.3参照物的选择益心舒片指纹图谱为针对处方君药人参中的皂苷类成分建立的指纹图谱，因此选择含量较高，保留时间适中，分离较好的人参皂苷Rb1作为参照物。1.4色谱条件考察1.4.1检测器的选择本实验主要针对皂苷类成分，而皂苷类成分最大紫外吸收波长为203nm，与流动相的截止波长接近，如果采用紫外检测器易造成吸收弱，干扰峰多，梯度洗脱时基线漂移等问题。故本文采用通用型的蒸发光散射检测器，试验证明基线几乎无漂移，峰数目少，且主要为皂苷类成分的色谱峰。1.4.2流动相的选择参照2015年版《中国药典》一部人参含量测定项下选择乙腈-水为流动相。1.4.3柱温的考察分别考察了柱温为20℃、25℃和30℃对分离效果的影响，结果3个柱温条件下12个共有峰均可得到较好的分离，柱温为25℃时各峰分离度及峰型最好，因此优选柱温为25℃。1.4.4流速的考察分别考察流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min、1.5ml/min对分离效果的影响，结果流速为0.9～1.1ml/min时12个共有峰均可得到较好的分离，流速1.0ml/min时各峰分离度及峰型最好，保留时间合适，因此优选流速为1.0ml/min。1.4.5色谱柱的考察对不同品牌的色谱柱进行考察，分别为：KromasilC18(4.6mm×250mm，5μm)、WatersSymmetryShieildTMC18(4.6mm×250mm，5μm)、Lunna5uC18100A(4.6mm×250mm，5μm)，结果显示，Waters和Lunna对样品的分离效果均较好，其中Waters的各峰分离度及峰型最好，因此优选WatersSymmetryShieildTMC18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱。1.4.6滞后峰测试延长测试时间100min，结果65min后无色谱峰，因此在益心舒片指纹图谱测定时，色谱条件适宜，无滞后成分影响样品测定，结果见图2。综上所述，确定益心舒片指纹图谱测定色谱条件为：色谱柱WatersSymmetryShieildTMC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相乙腈(A)-水(B)；梯度洗脱程序为0～20min，20％A；20～28min，20～28％A；28～45min，28～36％A；45～50min，36～65％A；50～55min，65％A；55～65min，65％A；流速1.0mL·min-1，柱温25℃；蒸发光散射检测器条件：蒸发温度105℃，载气N2，载气流速2.5mL·min-1，进样量10μL。1.5供试品溶液的制备考察几种制备方法对分离效果的影响。方法一：取益心舒片10片，不去包衣，直接研细，取约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，超声(250W，40kHz)处理1h，放冷，摇匀，过滤，精密量取滤液25ml，蒸干，残渣加水15ml溶解，用水饱和正丁醇萃取3次，每次30ml。合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次30ml，弃去氨试液，正丁醇液浓缩至干，残渣加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。方法二：取益心舒片10片，除去包衣，研细，取约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，超声(250W，40kHz)处理1h，放冷，摇匀，过滤，精密量取滤液25ml，蒸干，残渣加水15ml溶解，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20ml。合并正丁醇液，浓缩至干，残渣加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。方法三：取益心舒片10片，除去包衣，研细，取约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50ml，超声(250W，40kHz)处理1h，放冷，摇匀，过滤，精密量取滤液25ml，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。方法四：取益心舒片10片，除去包衣，研细，取约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50ml氯仿，超声(250W，40kHz)处理1h，过滤，滤渣挥干，加入具塞锥形瓶中，加入精密加入水饱和正丁醇50ml，超声(250W，40kHz)处理1h，放冷，摇匀，过滤，精密量取滤液25ml，用氨试液洗涤2次，每次30ml，弃去氨试液，正丁醇液浓缩至干，残渣加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。方法五：取益心舒片10片，除去包衣，研细，取约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50ml，超声(250W，40kHz)处理1h，放冷，摇匀，过滤，精密量取滤液25ml，用氨试液洗涤2次，每次30ml，弃去氨试液，正丁醇液浓缩至干，残渣加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。从考察结果的色谱图可以看出，包衣对40min后的峰有干扰，因此供试品溶液的制备中除去包衣；用氨试液洗涤后的供试品溶液基线平稳，杂质干扰少，因此采用氨试液洗涤；另外，索氏提取后的供试品溶液峰数量较少，不能全面反应样品的特征信息，因此去掉索提的步骤。综上所述，采用方法五制备供试品溶液。1.6精密度试验取批号为150120批的益心舒片，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取供试品10μl，重复进样6次，记录色谱图。以人参皂苷Rb1为参照峰，计算共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果见表2-1和表2-2。各峰相对保留时间的RSD均小于0.15％，相对峰面积的RSD均小于2.13％，表明仪器精密度良好。表2-1益心舒片皂苷类成分HPLC-ELSD指纹图谱精密度考察结果(相对保留时间)峰号123456RSD(％)10.6700.6710.6710.6700.6690.6700.11320.6910.6920.6930.6910.6910.6900.15130.9610.9620.9620.9620.9600.9610.087S1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00051.0391.0391.0391.0371.0381.0380.08561.0551.0541.0521.0531.0531.0520.10371.0671.0691.0661.0651.0671.0670.12581.1511.1541.1521.1511.1501.1520.117S1.2581.2581.2581.2601.2571.2570.088101.2961.2971.2991.2981.3001.2980.100111.3321.3321.3351.3331.3331.3340.094121.3981.4001.3971.3971.3981.3980.079表2-2益心舒片皂苷类成分HPLC-ELSD指纹图谱精密度考察结果(相对峰面积)1.7稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0h、3h、8h、11h、16h和24h进样，记录指纹色谱图谱，共测定6个时间点，以人参皂苷Rb1为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3-1和表3-2，各峰相对保留时间的RSD均小于0.13％，相对峰面积的RSD均小于2.89％，表明供试品溶液在24h内保持稳定。表3-1益心舒片皂苷类成分HPLC-ELSD指纹图谱稳定性考察结果(相对保留时间)峰号0h3h8h11h16h24hRSD(％)10.6700.6710.6710.6700.6710.6700.08520.6910.6930.6920.6920.6910.6930.13330.9610.9620.9610.9620.9620.9620.059S1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00051.0391.0391.0401.0411.0401.0380.09961.0551.0531.0531.0551.0551.0540.08971.0671.0661.0661.0661.0671.0680.07681.1511.1521.1521.1511.1531.1520.062S1.2581.2581.2591.2591.2581.2580.047101.2961.2981.2991.2971.2971.2980.072111.3321.3351.3341.3331.3341.3360.115121.3981.3971.3971.3991.3961.3990.086表3-2益心舒片皂苷类成分HPLC-ELSD指纹图谱稳定性考察结果(相对峰面积)峰号0h3h8h11h16h24hRSD(％)10.3990.4010.3990.3980.3990.40.26120.4170.4170.420.4170.4190.420.35930.0250.0250.0260.0260.0270.0262.886S1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00050.2240.2240.2230.2220.2240.2230.36960.0250.0250.0240.0250.0250.0262.55670.2150.2150.2150.2130.2140.2140.36280.2540.2530.2560.2550.2540.2530.459S1.1121.1151.1101.1131.1171.1110.232100.1720.1740.1740.1730.1720.1750.746110.1090.1080.1090.1100.1070.1061.374120.0620.0640.0620.0630.0650.0641.7821.8重复性试验取益心舒片样品，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，同法制备供试品溶液6份，依法测定。以人参皂苷Rb1为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表4-1和表4-2。结果各峰相对保留时间的RSD均小于0.11％，相对峰面积RSD均小于2.48％，结果表明该方法重复性良好。表4-1益心舒片指纹图谱重复性考察结果(相对保留时间)峰号123456RSD(％)10.6710.6710.6710.6700.6710.6710.06120.6920.6920.6930.6920.6910.6910.10830.9610.9630.9620.9620.9620.9630.08441.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00051.0391.0391.0401.0401.0411.0390.07461.0551.0541.0531.0541.0551.0550.07471.0671.0661.0661.0661.0671.0680.07681.1511.1521.1521.1511.1531.1520.062S1.2581.2581.2601.2591.2581.2600.085101.2961.2981.2991.2971.2971.2980.072111.3321.3331.3341.3311.3341.3340.100121.3981.3981.3971.3991.3961.3990.083表4-2益心舒片指纹图谱重复性考察结果(相对峰面积)峰号123456RSD(％)10.3990.4010.4010.3980.3990.3990.30920.4170.4160.4180.4170.4190.420.35230.0260.0260.0260.0260.0260.0260.000S1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00050.2230.2220.2230.2220.2260.2230.66060.0250.0240.0240.0250.0240.0252.43670.2150.2150.2120.2130.2130.2140.53880.2540.2530.2580.2550.2590.2530.99891.1121.1171.131.111.1191.1160.623100.1720.170.1760.1750.1720.1741.311110.1090.1080.1080.110.1080.1090.762120.0620.0610.0650.0630.0650.0642.4821.9指纹图谱的建立1.9.1十批益心舒片指纹图谱的检测取10批益心舒片，按上述规定的方法进行测定，不同批次的益心舒片指纹图谱见图3。1.9.2共有峰的确定及对照指纹图谱的获得将十批益心舒片指纹图谱的AIA格式从仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统A。选择10批益心舒片指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有峰。用平均值计算法生成益心舒片的对照指纹图谱，见图4。计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积和相似度，结果见表5-1、5-2、6。表5-1十批益心舒片共有峰相对保留时间表5-2十批益心舒片主峰相对峰面积表610批益心舒片指纹图谱相似度结果批号相似度批号相似度1501230.9571406010.9891501220.9831405010.9421501200.9711402160.9681411020.9751306010.9761406020.9361305010.999十批益心舒片指纹图谱与对照指纹图谱计算相似度，其结果均大于0.90，暂定益心舒片用益心舒片指纹图谱与对照指纹图谱经相似度软件计算，相似度不得低于0.90。根据十批指纹图谱中各共有峰相对峰面积和相对保留时间，暂定本品指纹图谱中各共有峰相对保留时间和相对峰面积应符合表7的限度范围。2.10益心舒片指纹图谱成分来源分析将处方中7味药材分别按草案中方法制备供试品溶液，进样分析，通过保留时间分析，指纹图谱中标定的12个共有峰，其中1、2、3、4、5、7、8号峰来自人参药材，6号峰来自黄芪药材，9、10、11、12号峰来自五味子药材。见图5。2.11色谱峰指认质谱条件：ESI离子源，正负离子模式，毛细管电压3500V，雾化室电压40psi，干燥气流速10L.min-1，加热毛细管温度350℃，源内裂解电压175V，传输电压65V，质量数扫描范围m/z100～1000，碰撞能量为20～25V。本实验用对照品比对，结合HPLC-Q-TOF-MS质谱图中化合物的质荷比及相关参考文献对主要共有峰进行了指认。在实验条件下，在试验条件下，供试品中的皂苷类成分对质谱负离子检测有较好的响应，其它类成分对质谱正离子检测有较好的响应。对照品比对的HPLC结果见图6，MS结果见表4。表4益心舒片主要共有峰的HPLC-Q-TOF-MS分析当前第1页1 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