一种用于流式细胞仪的荧光补偿方法与流程

本发明涉及本发明涉及流式细胞仪的荧光检测及光谱分析方法，特别涉及一种流式细胞仪的荧光补偿方法。

背景技术：

流式细胞仪是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术和单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。对悬液中处于高速、直线流动的单细胞或其他颗粒，通过检测散射光信号和(或)标记的荧光信号，实现高速逐一的多参数定量分析。在细胞生物学、细胞周期动力学、免疫学、血液学及肿瘤学等领域具有广泛的应用。

流式细胞仪的原理是单细胞悬液经特异性荧光染料染色后进入流式照射室，在流式照射室的分析点，激光照射到细胞发生散射和折射，发射出散射光，细胞所携带的荧光素被激发并发射出荧光、前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)。通过光电转换器件将荧光及散射光转换成电信号，前向散射光通过光电二极管转换成电信号，侧向散射光通过光电倍增转换成电信号，荧光则被聚光器收集，不同颜色的荧光被双色反光镜转向不同的光电倍增管检测器，将荧光信号转换成电信号，散射光信号和荧光信号经过放大后，再经过数据化处理，输入计算机并储存，根据细胞的散射光和荧光进行分析。

流式细胞仪多色荧光分析是指对检测样本同时标记多种荧光染料进行检测，目前所使用的各种荧光染料的激发或发射波长具有宽发射谱的性质，经光学滤片滤光后，发射光谱范围仍有一定的干扰重叠。目前，主要是按照各个接收波长范围内的信号强度即光强值进行荧光补偿。然而，光强具有波长相关性无法真实反应激发光及荧光团的对应关系。

因此，为了解决流式细胞仪多色分析过程中荧光光谱重叠造成测量误差的问题，需要一种能有效解决上述问题的流式细胞仪荧光检测和分析补偿方法。

技术实现要素：

根据本发明的一个方面，提供了一种流式细胞仪荧光补偿方法，包括以下步骤：步骤1)单阳性样本测试；步骤2)计算各通道荧光泄漏系数及荧光泄漏矩阵；步骤3)计算荧光补偿矩阵，根据荧光泄漏矩阵K求得补偿矩阵K K^-1；步骤4)补偿修正；步骤5)多色分析测试，对多色荧光染料染色的样本进行测试，记录各个检测通道的信号幅值；步骤6)荧光补偿。

优选地，在所述步骤1)中对各个单阳性样本进行荧光检测，调整传感器增益及后续处理电路的增益使检测通道的信号幅值在合适的范围内，调整完成后传感器增益及后续处理电路的增益在后续的测试过程中将保持不变。记录检测通道信号幅值及其他泄漏通道的泄漏信号幅值。

优选地，在所述步骤2)中对单个单阳性样本进行荧光检测，通过步骤1)中检测通道信号幅值与其他泄漏通道的泄漏信号幅值求出单个单阳性样本的检测通道相对于其他泄漏通道的泄漏系数k_ij；多个单阳性样本的泄漏系数按照一定的对应关系得到多个单阳性样本检测的荧光泄漏矩阵K。

优选地，所述荧光泄漏矩阵K为：

K矩阵为荧光泄漏矩阵,其中k_ij(i＝1,...,n；j＝1,...,n；)是荧光信号FL_i泄漏到荧光检测器PMT_j的荧光泄漏比率，FL矩阵为待求真实荧光信号矩阵。

优选地，所述泄漏矩阵的逆矩阵K^-1为“补偿矩阵”。

优选地，在所述步骤4)中由得到的荧光检测波长范围内光强与光子数的对应关系，得出各个检测通道的修正系数，并将多个检测通道的修正系数按照一定的对应关系组成修正矩阵，利用修正矩阵对荧光补偿矩阵进行修正。

优选地，所述步骤6)中对根据步骤5)中各个检测通道的信号幅值及步骤4)获得的修正后的荧光补偿矩阵对检测结果进行运算，得到荧光补偿后的荧光检测结果。

根据本发明的用于流式细胞仪的荧光补偿方法，可以解决流式细胞仪多色分析过程中荧光光谱重叠造成测量误差的问题，能有效解决现有领域中的流式细胞仪荧光检测和分析补偿。

应当理解，前述大体的描述和后续详尽的描述均为示例性说明和解释，并不应当用作对本发明所要求保护内容的限制。

附图说明

参考随附的附图，本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明，其中：

图1为本发明流式细胞仪荧光补偿方法的一个较佳实施方式示意图；

图2为流式细胞仪多色分析过程中的荧光重叠示意图；

图3为两色荧光信号检测及泄漏示意图；

图4为四色荧光信号检测及泄漏示意图。

具体实施方式

在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在附图中，相同的附图标记代表相同或类似的部件，或者相同或类似的步骤。

通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。

针对本发明结合示意图进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，表示器件结构的剖面图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是示例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间尺寸。

为了解决流式细胞仪多色分析过程中荧光光谱重叠造成测量误差的问题，本发明提出一种利用荧光光子数代替荧光光强的修正方法进行荧光补偿。

图1为根据本发明的用于对流式细胞仪进行荧光补偿方法的一个较佳实施方式示意图。如图1所示，根据本发明的流式细胞仪荧光补偿方法，包括以下步骤：

步骤101：单阳性样本测试；

具体地，在所述步骤101中对各个单阳性样本进行荧光检测，调整流式细胞仪的传感器增益及后续处理电路的增益使检测通道的信号幅值在合适的范围内，调整完成后传感器增益及后续处理电路的增益在后续的测试过程中将保持不变。记录检测通道信号幅值及其他泄漏通道的泄漏信号幅值。

步骤102：计算各通道荧光泄漏系数及荧光泄漏矩阵；

具体地，在所述步骤2)中对单个单阳性样本进行荧光检测，通过步骤101中检测通道信号幅值与其他泄漏通道的泄漏信号幅值求出单个单阳性样本的检测通道相对于其他泄漏通道的泄漏系数k_ij；多个单阳性样本的泄漏系数按照一定的对应关系得到多个单阳性样本检测的荧光泄漏矩阵K。荧光泄漏矩阵K的计算方法如下。

当根据本发明的流式细胞仪检测n种不同的荧光素分子时，任何一种荧光素的发射光都可能进入到其它的荧光检测通道，FL₁,…,FL_n分别代表n种荧光染料经激光照射后发射的荧光信号，PMT₁,…,PMTn分别代表n个目标荧光检测器实际测量的荧光信号，则任何一个通道检测到的荧光信号PMT₁,…,PMTn可以表示为：

PMT＝K×FL (1)

式(1)表明检测器实际测量的荧光信号等于荧光泄漏矩阵和荧光染料实际发射信号的乘积(不考虑检测样本自发荧光产生噪声信号)。式(1)中：

K矩阵为荧光泄漏矩阵,其中k_ij(i＝1,...,n；j＝1,...,n；)是荧光信号FL_i泄漏到荧光检测器PMT_j的荧光泄漏比率，FL矩阵为待求真实荧光信号矩阵。

步骤103：计算荧光补偿矩阵，根据步骤102得到的荧光泄漏矩阵K求得补偿矩阵K^-1；补偿矩阵K^-1的计算方法如下：

通过以上分析可得全矩阵补偿算法测得真实荧光强度的数学模型为：

FL＝K^-1×PMT (2)

全矩阵补偿是通过将由光检测器测出的实际荧光强度定义为矩阵并将预定的泄漏矩阵的逆作用于该矩阵，从而计算出从期望的荧光染料发出的荧光的真实强度。通过分析单独标记的各微粒的荧光波长分布得到泄漏矩阵，在泄漏矩阵中，各荧光染料的荧光波长分布被表示为列向量，并对这些列向量依次排列，泄漏矩阵的逆矩阵K^-1即为“补偿矩阵”。

步骤104：补偿修正；

具体地，在所述步骤104中由得到的荧光检测波长范围内光强与光子数的对应关系，得出各个检测通道的修正系数，并将多个检测通道的修正系数按照一定的对应关系组成修正矩阵。利用修正矩阵对荧光补偿矩阵进行修正。

步骤105：进行多色分析测试，对多色荧光染料染色的样本进行测试，记录各个检测通道的信号幅值；

步骤106：进行荧光补偿。

具体地，在所述步骤106中对根据步骤105中各个检测通道的信号幅值及步骤104获得的修正后的荧光补偿矩阵对检测结果进行运算，得到荧光补偿后的荧光检测结果。

为了更加精细的分析细胞特性而进行多色法荧光测量，即使用多种荧光染料标记微粒，并且使用具有不同接收光波段的多个光检测器(如PMT)测量从每种荧光染料所发射的荧光。利用多色法荧光测量时，通过根据使用的荧光染料的荧光波长选择在光检测器侧的滤光片进行荧光的检测。然而目前所使用的各种荧光染料的激发或发射波长具有宽发射谱的性质，经光学滤片滤光后，发射光谱范围仍有一定的干扰重叠。因此，若将这些染料组合进行多色测量，即使使用滤光片将从荧光染料发出的荧光分成各个波段，从非目标荧光染料发出的荧光也可能泄漏到目标荧光检测器。如果发生荧光泄漏，在光检测器处测量的荧光强度和来自目标荧光染料的真实荧光强度之间将存在差异，导致测量误差。

根据本发明，为了补偿测量误差，需要对检测器的实际测量值进行荧光补偿。荧光补偿是修正荧光信号渗漏的过程，其目的是从荧光目标检测器中除去除匹配荧光以外的任何干扰荧光信号。由488nm激光激发的荧光染料(FITC、PE、ECD、PE-Cy5、PE-Cy7)荧光发射光谱交叉重叠示意图如图2所示。图3为两色荧光信号检测及泄漏示意图；图4为四色荧光信号检测及泄漏示意图。

根据本发明的用于流式细胞仪的荧光补偿方法，可以解决流式细胞仪多色分析过程中荧光光谱重叠造成测量误差的问题，能有效解决现有领域中的流式细胞仪荧光检测和分析补偿。

结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。