本发明属于生物荧光显微成像领域，具体地，涉及一种化学层析成像方法，更具体地，设计一种利用化学手段实现快速有层析能力的成像方法。
背景技术：
：：荧光显微成像技术是目前生命科学研究中不可或缺的技术，随着分子生物学的发展和荧光标记技术的发展，针对荧光生物样品的成像方法也不断发展。在生命科学的研究中，大范围的获取连续的生物样品精细结构信息具有十分重要的意义。早期的普通荧光显微镜采用宽场照明成像的方式对生物样品成像，只能针对薄切片样本获得二维图像。为了获得生物样品的三维精细结构，荧光显微成像需要具有层析能力，以便能够分辨来自样品不同深度的信号。长期以来，已有的常用层析技术都是基于物理原理，主要有两种：一种是机械层析，即将样本切削成许多层薄片，每次只对其中一层成像，从而获得每一层的信息。但这种方法操作复杂，费时费力，后期配准也有相当的难度。另一种是光学层析，即利用光学原理抑制来自成像焦面外的干扰。长期以来，常用的具有光学层析能力的成像方法主要是共聚焦显微技术和双光子显微技术，但受限于其光学原理，这两种显微成像技术必须使用点扫描的成像方式，成像速度因此受到限制。另一方面，照明光对样本荧光，特别是成像焦面外的样本荧光的淬灭作用不可忽视，会对成像质量造成影响。近十年来，光片照明成像不断发展，作为一种具有光学层析能力的显微成像技术，逐渐得到广泛的应用。光片照明成像技术只照明成像焦面而不会照亮其他部分，采集数据时时可采用面成像的模式，相比于点成像的方式更快，荧光淬灭更小，但大部分的光片照明成像技术层析能力只能达到数微米的程度，并且光片照明技术对样本透明度有较高的要求，在对大样本，特别是不透明的大样本成像时受到很大的限制。鉴于以上提到的问题，针对生物组织样本，特别是不透明的大体积生物组织样本，发展一种新型的快速、高效的具有层析能力的高分辨成像方法是很有必要的。技术实现要素：针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种层析成像方法，其目的在于通过对某些特定的蛋白或染料标记的生物组织样本，采用化学手段在样品的准备阶段以及成像阶段对样品进行荧光的淬灭和重激活控制，结合机械切削和数据重建，获取生物样本的完整三维结构，由此解决现有的光片照明层析成像技术存在的层析能力不高、轴向分辨率低、成像速度慢、不能解决不透明的大生物样本的三维立体成像的技术问题。为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种层析成像方法，通过控制成像样品中荧光发色基团的结构变化，实现荧光的淬灭或激活，使得成像时只有样品表层的荧光基团能够被激发，从而实现仅对样品的表层成像。优选地，所述层析成像方法包括如下步骤：(1)激活：将不发荧光的原始生物组织样本或只发特定波段荧光的原始生物组织样本的表层荧光激活，得到已激活的表层生物组织样本；所述原始生物组织样本为蛋白或荧光染料标记的生物组织样本；(2)成像：对步骤(1)获得的已激活的表层生物组织样本进行荧光激发并进行荧光成像，获得所述已激活的表层生物组织样本的荧光图像。优选地，所述层析成像方法还包括：(3)削除所述已激活的表层生物组织样本，露出未激活的新表层，得到新的生物组织样本，并以该新的生物组织样本作为所述原始生物组织样本；(4)跳转执行所述步骤(1)，直至所述原始生物组织样本厚度小于所述表层生物组织样本厚度；(5)将获得的各个所述表层生物组织样本的荧光图像进行叠加处理，获得所述原始生物组织样本的完整三维图像。优选地，所述不发荧光的原始生物组织样本包括1)本身不发荧光的蛋白标记或荧光染料标记的生物组织样本或2)荧光可逆性淬灭的蛋白标记或荧光染料标记的生物组织样本。优选地，所述层析成像方法获得的生物组织样本的荧光图像的轴向分辨率为亚微米量级。优选地，所述蛋白包括荧光蛋白和/或结合配体能够激发出荧光的蛋白。优选地，所述荧光可逆性淬灭的方法包括使用化学试剂浸泡使所述荧光蛋白或荧光染料的荧光基团可逆性淬灭的方法。优选地，所述荧光可逆性淬灭的方法为利用酸性化学试剂淬灭处理、利用过渡态金属离子化合物溶液淬灭处理或氢离子与过渡态金属离子的协同淬灭处理。优选地，所述激活处理方法包括化学试剂处理或光化学处理，使所述生物组织样本表层的蛋白或荧光染料被激活，而样本表层以下的蛋白或荧光染料不被激活。优选地，所述化学试剂处理方法包括将蛋白或荧光染料标记的生物组织样本浸泡在化学试剂中，只有样本的表层被化学试剂渗透，从而只有样本的表层荧光被激活。优选地，所述化学试剂处理方法为碱液激活处理、金属离子螯合剂激活处理或碱液与金属离子螯合剂的协同激活处理。优选地，所述光化学处理方法包括使用特定波长的光进行激活，该激活光只能穿透所述蛋白或荧光染料标记的生物组织样本的表层，从而只有样本表层荧光被激活。总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。(1)本发明的层析成像方法在用于生物样本的层析成像时，激活时仅激活样本表层荧光，被激活表层的厚度即为层析成像的轴向分辨率，层析效果好，能够获得亚微米量级的轴向分辨率；(2)本发明的层析成像方法，由于在荧光成像前将蛋白或荧光染料的荧光进行消除，或采用本身不发荧光或者不发特定波长的荧光蛋白或荧光染料，激活时只激活样本表层荧光，激发并进行表层荧光成像时没有背景荧光的干扰，可采用面成像的模式，高通量地获取成像数据，成像速度快；(3)本发明的层析成像方法采用激活-成像-削除的步骤，成像时不受样品大小的限制，对样本的透明度也没有要求，可用于各种体积、各种透明度的样本成像，且用于大样本的成像时其高通量优势更加凸显，成像时间缩短；(4)本发明的层析成像方法通过预先对样本中的荧光基团进行可逆性淬灭，然后在成像时仅激活样本表层荧光，从而保护了未激活荧光不被成像时的照明光淬灭，在长时间成像时不会由于光淬灭效应对成像质量造成影响。附图说明图1是本发明的层析成像方法的流程框图；图2是本发明淬灭-激活-成像-切削的层析成像方法的流程示意图；图3是光激活荧光蛋白PAGFP的光激活过程原理示意图；图4是光转换荧光蛋白mEos3.1的光转换过程原理示意图；图5是pH敏感荧光蛋白EGFP的荧光淬灭及激活过程原理示意图；图6是有机荧光染料分子Alexa488的荧光淬灭及激活过程原理示意图；图7是pH稳定荧光蛋白DsRed的荧光淬灭及激活过程原理示意图；图8为实施例1小鼠大脑部分脑区的三维立体图像；图9是实施例2碱性溶液激活前后荧光强度对比图；图9(A)为实施例1树脂包埋前荧光强度；图9(B)为实施例1树脂包埋后碱性溶液激活前荧光强度；图9(C)为树脂包埋后碱性溶液激活后荧光强度；图9中比例尺代表50微米；图10为实施例3小鼠大脑部分脑区的三维立体图像和展示标记细节的二维图像。其中图10A为某个神经元的三维立体图像，图10B为该神经元的二维图像，图10C显示了轴突和轴突小结(axonbouton),图10D显示了该神经元的树突和树突棘(dendriticspine)；图11是实施例4所用光控荧光蛋白激活激发前后荧光强度对比图；图11(A)为实施例4激活前激发的荧光强度；图11(B)为实施例4激活后激发的荧光强度，其中激活光波长为405nm；其中图11的比例尺代表20微米；图12是实施例5所用光控荧光蛋白激活激发前后荧光强度对比图；图12(A)为实施例5激活前激发的荧光强度；图12(B)为实施例5激活后激发的荧光强度。图13是实施例6中Alexa488荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织的淬灭-激活成像。图13(a)是Alexa488荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织的淬灭后的图像，其对比度增大10倍；图13(b)是Alexa488荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织的重激活图像；图14是实施例7中DsRed标记的鼠脑组织的荧光淬灭-激活成像。图14(a)是DsRed标记鼠脑的荧光淬灭后的图像，其对比度增大100倍；图14(b)是DsRed标记鼠脑的荧光重激活图像。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。本发明提供的一种层析成像方法，通过控制成像样品中荧光发色基团的结构变化，实现荧光的淬灭或激活，使得成像时只有样品表层的荧光基团能够被激发，从而实现仅对样品的表层成像。图1为本发明的层析成像方法的流程图，本发明提供的层析成像方法，包括如下步骤：(1)样本准备：采用蛋白或荧光染料标记生物组织样本，其不发荧光或只发特定荧光；(2)激活：将不发荧光或只发特定波段荧光的原始生物组织样本的表层荧光激活，得到已激活的表层生物组织样本；(3)成像：对步骤(2)获得的已激活的表层生物组织样本进行荧光激发并进行荧光成像，获得所述已激活的表层生物组织样本的荧光图像。(4)削除所述已激活的表层生物组织样本，露出未激活的新表层，得到新的生物组织样本，并以该新的生物组织样本作为所述原始生物组织样本；(5)跳转执行所述步骤(2)，直至所述原始生物组织样本厚度小于所述表层生物组织样本厚度；(6)将获得的各个所述表层生物组织样本的荧光图像进行叠加处理，获得所述原始生物组织样本的完整三维图像。其中，蛋白包括荧光蛋白和/或结合配体可以激发出荧光的蛋白，其中荧光蛋白优选为pH敏感的荧光蛋白、pH稳定的荧光蛋白和/或光控荧光蛋白，荧光染料优选有机荧光染料分子。pH敏感的荧光蛋白，包括水母来源的绿色荧光蛋白及其衍生物、mOrange及其衍生物或mApple及其衍生物；绿色荧光蛋白及其衍生物可以为BFP、EBFP、EBFP2、CFP、ECFP、GFP、EGFP、YFP或EYFP等，优选为EGFP或EYFP；mApple及其衍生物为pHuji的红色荧光蛋白。光控荧光蛋白包括光激活荧光蛋白(PhotoactivatableFPs，PAFPs)中的一种或多种，如PAGFP、PAmCherry1等；或者光转换荧光蛋白(photoswitchableFPs，rsFPs)中的一种或多种，如Dendra2、mEos3.1等。有机荧光染料分子优选Alexa系列荧光染料分子，优选Alexa488、Alexa514、Alexa532和/或Alexa546中的一种或多种。pH稳定的荧光蛋白，优选红色荧光蛋白DsRed。用于标记生物组织的蛋白或荧光染料为本身不发荧光或者只发特定波长荧光的蛋白或荧光染料，或荧光被可逆性淬灭了的蛋白或荧光染料。对于本身不发荧光或只发特定波段荧光的光控荧光蛋白，可以不做任何处理，直接进行表层的激活步骤处理。对于本身发荧光的蛋白或荧光染料，先将其荧光进行可逆性淬灭。可逆性淬灭的方法包括使用化学试剂浸泡使所述荧光蛋白或荧光染料的荧光基团可逆性淬灭的方法，优选利用酸性化学试剂处理、利用过渡态金属离子化合物溶液处理或利用氢离子与过渡态金属离子的协同淬灭处理方法。图2是本发明淬灭-激活-成像-切削的层析成像方法的流程示意图，对于需要先淬灭蛋白或荧光染料的荧光的生物组织样本的层析成像，如图2所示，样本准备时先将荧光先淬灭使其不发荧光，然后再通过激活表层、成像表层、切削表层，然后再激活表层-成像表层-切削表层，如此循环，直至样本成像完毕，获得生物组织样本的完整图像。激活处理方法包括化学试剂处理或光化学处理，使所述生物组织样本表层的荧光蛋白或荧光染料被激活，而样本表层以下的蛋白或荧光染料不被激活。化学试剂处理方法包括将蛋白或荧光染料标记的生物组织样本浸泡在化学试剂中，只有样本的表层被化学试剂渗透，从而只有样本的表层荧光被激活。激活化学试剂优选为碱液激活、金属离子螯合剂激活或氢氧根与金属离子螯合剂的协同激活。光化学方法包括使用特定波长的光进行激活，该激活光只能穿透所述蛋白或荧光染料标记的生物组织样本的表层，从而只有样本表层荧光被激活。蛋白或荧光染料也可以原本不发荧光，或只发某种颜色的荧光，经过特定波长的激活光激活以后，可以被另一波长的光激发而发出另一种颜色的荧光。当采用光控荧光蛋白标记生物组织样本时，可以将生物组织包埋样品在非成像光路上用激活光激活样品表层的光控荧光蛋白，然后在成像光路上用对应波长的激发光激发该荧光蛋白并成像。成像光路指接收发射光谱(即荧光信号)的光路，非成像光路指成像光路之外的其他光路。“激活”是指，光控荧光蛋白在特定波长激发光的激发下，几乎不发某个波段的荧光，只有经过另外某个波长的“激活光”激活后，开启了荧光蛋白，使之接受特定波长激发光激发从而发出荧光。而“激发”是指荧光蛋白吸收某个波长的光发出荧光的过程。其中，光激活荧光蛋白本身不发荧光，只有经过特定波长的激活光激活样品表层时，表层被激活的荧光在另一特定波长的激发下，可以荧光成像；而光转换荧光蛋白本身只发某种颜色的荧光，经过特定波长的激活光激活样品表层以后，被激活的表层荧光在另一波长的激发光的激发下进行荧光成像。激活光只能激活样品的表层，激活光相对于激发光来说，一般波长更短，其穿透组织的能力差一些，因此激活光只能穿透激活更表层的荧光蛋白；激活光的激活可以控制激活光与被激活样品的角度，角度越小，表面反射越强，这样深层的激活光不仅进入的少了，而且进入的能量密度低了。因此本发明选择在样品的非成像光路上，用激活光激活样品表层的光控荧光蛋白，然后在成像光路上用对应波长的激发光激发该荧光蛋白并荧光成像，这样来实现样品的表层成像。激活光为与所述光控荧光蛋白匹配的特定波长的激活光。激发光为与所述光控荧光蛋白匹配的特定波长的激发光。激活光的方向和激发光的方向的夹角为0～90°，优选为60～75°。可以通过优化选择激活光的波长，优化选择激活光与激发光的夹角，即选择合适的激活方向，来控制样品表层被激活的厚度，样品表层被激活的厚度即为样品荧光图像的轴向分辨率。当采用pH敏感的荧光蛋白标记生物组织的包埋样品时，可以通过添加酸液或者化学试剂使溶液的pH在3～5之间，使pH敏感的荧光蛋白淬灭。然后激活时可以将荧光淬灭的样品浸泡在碱性溶液中就会化学重激活样品表层pH敏感荧光蛋白的荧光。碱性溶液pH值在8至13之间，优选范围11至12之间，碱性溶液，优选为碳酸钠溶液、有机胺溶液、氨水或其混合物。碱性溶液激活时，只有样品的削除面，即机械切削面的表层被激活，其它非机械切削面的表面，由于非常光滑，表面张力很大，碱性溶液很难渗透进去。另外，也可以在非机械切削的表面添加疏水物质的涂层，阻止碱性溶液从非机械切削面渗透进入样品。碱性溶液的种类和粘度、包埋剂的种类和各组分的配比等因素，都影响碱性溶液在包埋样品机械切削面的渗透速度。通过控制合适的碱性溶液渗透速度，来控制荧光成像的轴向分辨率，实现高分辨快速成像。当采用有机荧光染料分子标记生物组织时，通过利用过渡金属离子与有机荧光染料分子形成六元环，降低有机荧光分子的共轭π电子密度，从而将有机荧光染料分子标记在生物组织上的荧光猝灭，淬灭可控且可逆；再通过利用螯合剂与金属离子形成配位健，其结合能力大于金属离子与有机荧光分子的结合力，从而破坏金属离子与有机荧光分子的结合，恢复其共轭π电子结构，重激活有机荧光染料分子的荧光，重激活方便，效果好，可以根据需要精确控制淬灭和重激活的荧光亮度。其中过渡金属离子化合物优选为Cr2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu+和/或Cu2+中的一种或多种的化合物，优选为Fe3+的化合物，进一步优选为FeCl3或Fe2(SO4)3。金属离子螯合剂为EDTA-Na4、8-羟基喹啉、N-油酰肌氨酸、二乙二胺和/或去铁敏螯合剂的一种或多种，优选为去铁敏或EDTA-Na4。当采用pH不敏感的荧光蛋白，比如红色荧光蛋白DsRed标记生物组织时，利用过渡金属离子和氢离子的协同作用将红色荧光蛋白标记的生物组织荧光淬灭，利用金属离子螯合剂和氢氧根离子的协同作用将荧光淬灭的生物组织的荧光重激活，实现DsRed标记的生物组织的荧光的精确控制。生物组织样本的表层被激活的厚度即为层析成像时的轴向分辨率，采用化学试剂重激活，化学试剂的种类和粘度、生物组织包埋时包埋剂的种类和各组分的配比等因素，都影响化学试剂在包埋样品机械切削面的渗透速度。通过控制合适的化学试剂在样品表面的渗透速度，控制激活时间，来控制荧光成像的轴向分辨率，实现高分辨快速成像。各种蛋白或荧光染料标记的生物组织样本表层激活以后，利用对应其激发波长的激光作为激发光源，经过光束整形后透过物镜照射到样品表面，利用同一个物镜收集所激发的荧光。由于样品深层的荧光不会被激发，成像时没有轴向背景干扰，因此可以采用自身没有层析能力的光学系统进行成像，如宽场成像、时间延迟积分成像等。本发明提供的一种层析成像方法，可以认为是一种化学层析成像方法，通过控制成像样品中荧光发色基团的结构变化，实现荧光的淬灭或激活，使得成像时只有样品表层的荧光基团能够被激发，从而实现仅对样品的表层成像。PAGFP(PhotoactivatableGreenFluorescentProtein)光激活绿色荧光蛋白是一种典型的光激活荧光蛋白，其激活过程是一个不可逆过程。未激活时，用激发光(通常为488-515nm波长)照射时基本不发荧光；用紫外光(通常为405nm波长)激活后，发色基团发生去质子化，成为可发荧光的状态，荧光强度较激活前增强约100倍，此过程如图3所示。而mEosFP则是一种典型的光转换荧光蛋白，以mEos3.1为例：在非激活状态下，mEos3.1可以被激发出绿色荧光，利用紫外光(通常为405nm波长)照射后，荧光分子中特定的化学键会发生断裂，造成不可逆的光转换，从绿色荧光转换为红色荧光，此过程如图4所示。EGFP(EnhancedGreenFluorescentProtein)增强型绿色荧光蛋白是一种典型的pH敏感荧光蛋白。处于酸性环境中的GFP发色基团，在氢离子的作用下发生质子化，在此状态下的GFP几乎不会被激发光激发出荧光；而将质子化的GFP置于碱性环境中时，由于氢氧根离子的存在，发色基团会发生去质子化，此时GFP可以正常被激发出荧光。此过程是一个可逆过程，如图5所示。以Alexa488有机荧光分子染料为例：Alexa488荧光染料分子的发色团在过渡态金属离子的作用下，分子形态会发生改变，变为不可被激发出荧光对形式；而利用金属螯合剂处理处于非激发态下的荧光染料分子，会使得金属离子被螯合剂抢夺，发色团恢复到可发荧光的形式。此过程如图6所示。DsRed是一种pH稳定的荧光蛋白，DsRed在过渡态金属离子与氢离子的共同作用下，发色基团可逆性发生变化，在此形式下不能被激发出荧光；之后利用碱性金属螯合剂处理，发色基团会回到可激发荧光的形式，过程如图7所示。本发明的层析成像方法由于在成像前，有意通过一定的手段消除成像时的背景荧光，比如将荧光蛋白或荧光染料标记的生物组织样本先采用化学试剂浸泡，使其荧光发色基团发生变化而淬灭，该淬灭为可逆性地，激活时该淬灭的荧光可以重新激活。激活时采用激活化学试剂只激活表层，表层的荧光被激活以后，进行激发并荧光成像时，由于表层以下的荧光没有被激活，仍旧处于淬灭的状态，因此表层成像时没有背景干扰。对于某些蛋白，比如光控荧光蛋白标记生物组织样本时，光控荧光蛋白本身不发荧光或只发特定波长的荧光，激活时只激活表层，激发表层并荧光成像时，只发特定波长的荧光表层被激活后，再对激活的表层用另一特定波长的激发光激发时，表层以下的荧光波长与表层的荧光波长范围不同，也不会有背景干扰的问题。本发明的层析成像方法通过控制样本表层的激活厚度来获得高分辨率的荧光图像，其轴向分辨率为亚微米级，分辨率范围为500～2000nm。本发明的层析成像方法由于没有背景荧光干扰的问题，可以进行面成像，进行高通量的获取荧光成像数据，成像速度快，对生物组织样本的体积大小和透明度也没有限制，大体积的生物组织样本成像时其高通量优势更加凸显，成像时间缩短。本发明的层析成像方法由于预先对样本中的荧光基团进行可逆性淬灭，在成像是仅激活了样本的表层荧光，从而保护了未激活荧光不被成像时的照明光淬灭，在长时间成像时不会由于光淬灭效应对成像质量造成影响。本发明的生物组织样品可以为通过树脂包埋的生物组织包埋样品。削除样品表层可以为机械切削的方式削除样品的表层，切削系统为可进行超薄切削，即可进行10μm厚度以下切削的表面切削手段，更优选地为震动切削或金刚石刀切削。本发明的成像系统可选择用于三维成像的任意成像系统，优选为可移动样品进行成像的宽场成像系统。以下为实施例：实施例1Thy1-EGFP-M小鼠全脑的化学层析成像，包括以下步骤：(1)样本固定。将Thy1-EGFP-M小鼠全脑用化学固定手段固定，得到固定的鼠脑生物组织。具体步骤如下：在4摄氏度下，将心脏灌流后，解剖出的小鼠全脑经质量分数为4％的PFA溶液浸泡约12小时，PFA溶液用量为20ml每只，然后用PBS溶液漂洗三次，每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗四小时。(2)样本脱水。将固定的鼠脑组织用乙醇置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的EGFP标记的小鼠全脑。具体步骤为：在4摄氏度下，将固定的小鼠全脑依次通过梯度乙醇双蒸水溶液20ml，浸泡2小时，进行脱水。乙醇双蒸水溶液浓度梯度为乙醇按照体积百分比为50％，75％，95％，100％，100％。(3)包埋剂渗透及荧光淬灭处理。将脱水后的小鼠全脑进行HM20包埋剂渗透处理，获得HM20包埋剂工作液填充的小鼠全脑。具体步骤为：在4摄氏度下，将脱水后的小鼠全脑依次通过梯度HM20的二甲苯溶液5ml以上，进行包埋剂渗透。HM20的二甲苯溶液梯度为HM20按照体积百分比为50％，75％，100％，100％，100％，100％，前三个梯度每个梯度浸泡2小时，第四组和第五组各浸泡24小时，第六组浸泡14小时(第六组浸泡前将树脂工作液加入醋酸混合，每5ml树脂工作液加入25～30微升醋酸)，使树脂工作液的pH为3.5～4.0。(4)包埋剂聚合。使所述HM20包埋剂发生聚合反应，获得EGFP标记的生物组织的树脂包埋样品，具体步骤为：将1.1mL的混合无水醋酸的HM2O包埋剂工作液注入安装在底座上的9mm口径的明胶胶囊，然后将HM20包埋剂工作液填充的小鼠全脑放入胶囊中，调整好位置并盖上胶囊盖子，移入真空干燥箱中进行梯度升温聚合：37摄氏度12小时，42摄氏度3小时，45摄氏度12小时，50摄氏度3小时。(5)碱性溶液重激活pH敏感荧光蛋白。将所述树脂包埋小鼠全脑样品浸泡在pH值为11.2的0.05摩尔每升的碳酸钠溶液中。碱性溶液在树脂包埋小鼠全脑样品中的渗透速度约为1微米/分钟，得到已激活的表层。(6)荧光显微断层成像对已激活的表层进行激发荧光成像，机械切削掉成像过的已激活表层，露出新的表层接触碱性溶液，然后再重激活新表层的荧光并激发成像，然后再切削、激活、成像，如此反复断层成像直至获取整个样品的所有二维图像。所获取的二维图像自动配准获取样品的三维图像(如图8所示)。从图8中，可以清晰分辨神经元的树突棘(Spine)，轴突小结(axonbouton)等亚微米结构，能够在密集的神经元轴突纤维群中区分出单根轴突，能够追踪出神经元的完整投射形态。实施例2过表达pH敏感荧光蛋白pHuji的小鼠全脑的化学层析成像方法，包括以下步骤：(1)样本固定。将pHuji过表达的小鼠全脑用化学固定手段固定，得到固定的pHuji标记的生物组织。具体步骤如下：在4摄氏度下，将心脏灌流后，解剖出的小鼠全脑经质量分数为4％的PFA溶液浸泡约12小时，PFA溶液用量为20ml每只，然后用PBS溶液漂洗三次，每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗四小时。(2)样本脱水。将固定的pHuji标记的小鼠全脑用乙醇置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的pHuji标记的小鼠全脑。具体步骤为：在4摄氏度下，将固定的pHuji标记的小鼠全脑依次通过梯度乙醇双蒸水溶液20ml，浸泡2小时，进行脱水。乙醇双蒸水溶液浓度梯度为乙醇按照体积百分比为50％，75％，95％，100％，100％。(3)包埋剂渗透及荧光淬灭处理。将脱水后的pHuji标记的小鼠全脑进行HM20包埋剂渗透处理，获得HM20包埋剂工作液填充的pHuji标记的小鼠全脑。具体步骤为：在4摄氏度下，将脱水后的pHuji标记的小鼠全脑依次通过梯度HM20的二甲苯溶液5ml以上，进行包埋剂渗透。HM20的二甲苯溶液梯度为HM20按照体积百分比为50％，75％，100％，100％，100％，100％，前三个梯度每个梯度浸泡2小时，第四组和第五组各浸泡24小时，第六组浸泡14小时(第六组浸泡前将树脂工作液加入醋酸混合，每5ml树脂工作液加入25～30微升醋酸)，使树脂工作液的pH为4.5～5.0。(4)包埋剂聚合。使所述HM20包埋剂发生聚合反应，获得pHuji标记的生物组织的树脂包埋样品。具体步骤为：将1.1mL的混合无水醋酸的HM2O包埋剂工作液注入安装在底座上的9mm口径的明胶胶囊，然后将HM20包埋剂工作液填充的pHuji标记的小鼠全脑放入胶囊中，调整好位置并盖上胶囊盖子，移入真空干燥箱中进行梯度升温聚合：37摄氏度12小时，42摄氏度3小时，45摄氏度12小时，50摄氏度3小时。(5)碱性溶液重激活pH敏感荧光蛋白。将所述树脂包埋小鼠全脑样品浸泡在pH值为11.6的0.1摩尔每升的碳酸钠溶液中，碱性溶液在树脂包埋小鼠全脑样品中的渗透速度约为1微米/分钟，得到已激活的表层，激活表层厚度为0.5～1微米。采用激光器激发碱性溶液激活处理的样品表面的荧光蛋白，进行荧光成像。碱性溶液激活处理后和碱性溶液激活处理前，荧光亮度如图9所示。图9是实施例2碱性溶液激活前后荧光强度对比图；图9A为实施例2树脂包埋前荧光强度；图9B为实施例2树脂包埋后碱性溶液激活前荧光强度；图9C为树脂包埋后碱性溶液激活后荧光强度。可以看到，经过淬灭处理后的树脂包埋样品几乎不发荧光，而样品经过碱性溶液激活后，荧光强度得到了很好的恢复。(6)荧光显微断层成像对已激活的表层进行激发荧光成像，机械切削掉成像过的已激活表层，露出新的表层接触碱性溶液，然后再重激活新表层的荧光并成像，然后再切削、激活、成像，如此反复断层成像直至获取整个样品的所有二维图像。所获取的二维图像自动配准获取样品的三维图像，z向分辨率为0.5～1微米。实施例3过表达EYFP小鼠全脑的化学层析成像方法，包括以下步骤：(1)样本固定。将过表达EYFP小鼠全脑用化学固定手段固定，得到固定的鼠脑生物组织。具体步骤如下：在4摄氏度下，将心脏灌流后，解剖出的小鼠全脑经质量分数为4％的PFA溶液浸泡约12小时，PFA溶液用量为20ml每只，然后用PBS溶液漂洗三次，每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗四小时。(2)样本脱水。将固定的鼠脑组织用乙醇置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的EGFP标记的小鼠全脑。具体步骤为：在4摄氏度下，将固定的小鼠全脑依次通过梯度乙醇双蒸水溶液20ml，浸泡2小时，进行脱水。乙醇双蒸水溶液浓度梯度为乙醇按照体积百分比为50％，75％，95％，100％，100％。(3)包埋剂渗透及荧光淬灭处理。将脱水后的小鼠全脑进行HM20包埋剂渗透处理，获得HM20包埋剂工作液填充的小鼠全脑。具体步骤为：在4摄氏度下，将脱水后的小鼠全脑依次通过梯度HM20的二甲苯溶液5ml以上，进行包埋剂渗透。HM20的二甲苯溶液梯度为HM20按照体积百分比为50％，75％，100％，100％，100％，100％，前三个梯度每个梯度浸泡2小时，第四组和第五组各浸泡24小时，第六组浸泡14小时(第六组浸泡前将树脂工作液加入醋酸混合，每5ml树脂工作液加入25～30微升醋酸)，使树脂工作液的pH为4.0～4.5。(4)包埋剂聚合。使所述HM20包埋剂发生聚合反应，获得EYFP标记的生物组织的树脂包埋样品。具体步骤为：将1.1mL的混合无水醋酸的HM2O包埋剂工作液注入安装在底座上的9mm口径的明胶胶囊，然后将HM20包埋剂工作液填充的小鼠全脑放入胶囊中，调整好位置并盖上胶囊盖子，移入真空干燥箱中进行梯度升温聚合：37摄氏度12小时，42摄氏度3小时，45摄氏度12小时，50摄氏度3小时。(5)碱性溶液重激活pH敏感荧光蛋白。所述树脂包埋小鼠全脑样品浸泡在pH值为11.2的碳酸钠和甘油的混合溶液中，其中碳酸钠的浓度为0.05摩尔/升，甘油的体积百分数为20％。这种混合碱性溶液在树脂包埋小鼠全脑样品中的渗透速度约为0.5微米/分钟，得到已激活的表层，激活表层厚度为0.5～1微米。(6)荧光显微断层成像对已激活的表层进行激发荧光成像，然后机械切削掉成像过的已激活表层，露出新的表层接触碱性溶液，然后再重激活新表层的荧光并激发成像，然后再切削、激活、成像，如此反复断层成像直至获取整个样品的所有二维图像。所获取的二维图像(图10B)自动配准获取样品的三维图像(如图10A所示)。从图10中，可以清晰分辨神经元的树突棘(图10D)，轴突小结(图10C)等亚微米结构，z向分辨率为0.5～1微米。实施例4大脑皮层注射有Rv-dg-mEos3.1的小鼠全脑的光化学激活层析成像。mEos3.1是一种常见的光转换荧光蛋白。其光学特性是，未在紫外405nm波长激活之前，只发绿色荧光(激发波长488nm)，不发红色荧光；经过紫外405nm波长短时间激活后，在561nm激发光下，发红色荧光(发射光谱在550nm以上)。大脑皮层注射有Rv-dg-mEos3.1的小鼠全脑的化学层析成像方法，包括以下步骤：(1)样本固定将Rv-dg-mEos3.1感染的小鼠全脑用化学固定手段固定，得到固定的mEos3.1标记的生物组织。具体步骤如下：在4摄氏度下，将心脏灌流后，解剖出的小鼠全脑经质量分数为4％的PFA溶液浸泡约12小时，PFA溶液用量为20ml每只，然后用PBS溶液漂洗三次，每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗四小时。(2)样本脱水将固定的mEos3.1标记的小鼠全脑用乙醇置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的mEos3.1标记的小鼠全脑。具体步骤为：在4摄氏度下，将固定的mEos3.1标记的小鼠全脑依次通过梯度乙醇双蒸水溶液20ml，浸泡2小时，进行脱水。乙醇双蒸水溶液浓度梯度为乙醇按照体积百分比为50％，75％，95％，100％，100％。(3)包埋剂渗透处理将脱水后的mEos3.1标记的小鼠全脑进行HM20包埋剂渗透处理，获得HM20包埋剂工作液填充的mEos3.1标记的小鼠全脑。具体步骤为：在4摄氏度下，将脱水后的mEos3.1标记的小鼠全脑依次通过梯度HM20的二甲苯溶液5ml以上，进行包埋剂渗透。HM20的二甲苯溶液梯度为HM20按照体积百分比为50％，75％，100％，100％，100％，100％，前三个梯度每个梯度浸泡2小时，第四组和第五组各浸泡24小时，第六组浸泡14小时。(4)包埋剂聚合使所述HM20包埋剂发生聚合反应，获得mEos3.1标记的生物组织的树脂包埋样品。具体步骤为：将1.1mL的HM2O包埋剂工作液注入安装在底座上的9mm口径的明胶胶囊，然后将HM20包埋剂工作液填充的mEos3.1标记的小鼠全脑放入胶囊中，调整好位置并盖上胶囊盖子，移入真空干燥箱中进行梯度升温聚合：37摄氏度12小时，42摄氏度3小时，45摄氏度12小时，50摄氏度3小时。(5)激活激发光控荧光蛋白将处理完毕后的样本固定于成像系统中，利用系统中的金刚石刀具将样品切削至待成像位置，将成像系统调节至最佳成像状态；用波长405nm的激活光照明样品，移动样品以使激活光能够覆盖整个样品表面，激活光的照明会激活样品表层荧光，激活光激活处理前和激活处理后分别激发的荧光亮度如图11所示。图11是所用光控荧光蛋白激活激发前后荧光强度对比图；图11A为激活前激发的荧光强度；图11B为激活后激发的荧光强度。可以看到，激活前样本基本没有荧光信号，经过激活后，一个神经元胞体可以被观察到，说明激活光照明后激活了样本表面的荧光蛋白，被激活表层厚度为1～2微米。然后用561nm激发光激发荧光并成像，激活光方向和激发光方向的夹角为60°。用宽场成像的方式对样本表面进行成像，移动样品以获取样本整个表面的图像。(6)荧光显微断层成像表面成像完毕后，将样本移至金刚石刀具下进行切削，将已成像表面切削掉，露出新的表层，然后激活新表层的光控荧光蛋白并激发荧光成像，然后再重复“激活”、“成像”、“削除”的过程，如此反复断层成像直至获取整个样品的所有二维图像。所获取的二维图像自动配准获取样品的三维荧光图像，Z向分辨率为1～2微米。实施例5过表达PAGFP的Hela细胞包埋后光化学层析成像方法，包括以下步骤：(1)样本固定将过表达PAGFP的Hela细胞用化学固定手段固定，得到固定的PAGFP标记的生物组织。具体步骤如下：在4摄氏度下，将Hela细胞经质量分数为4％的PFA溶液浸泡约12小时，然后用PBS溶液漂洗3次，每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗1小时。(2)样本脱水将固定的PAGFP标记的Hela细胞用乙醇置换，使得所述样本脱水，得到脱水后的PAGFP标记的细胞样本。具体步骤为：在4摄氏度下，将固定的PAGFP标记的Hela细胞依次通过梯度乙醇双蒸水溶液20ml，浸泡2小时，进行脱水。乙醇双蒸水溶液浓度梯度为乙醇按照体积百分比为50％，75％，95％，100％，100％。(3)包埋剂渗透处理将脱水后的PAGFP标记的小鼠全脑进行HM20包埋剂渗透处理，获得HM20包埋剂工作液填充的PAGFP标记的细胞样本。具体步骤为：在4摄氏度下，将脱水后的PAGFP标记的Hela细胞依次通过梯度HM20的二甲苯溶液5ml，进行包埋剂渗透。HM20的二甲苯溶液梯度为HM20按照体积百分比为50％，75％，100％，100％，100％，100％，前三个梯度每个梯度浸泡2小时，第四组和第五组各浸泡24小时，第六组浸泡14小时。(4)包埋剂聚合使所述HM20包埋剂发生聚合反应，获得PAGFP标记的树脂包埋的细胞样本。具体步骤为：将HM2O包埋剂工作液滴到长有Hela细胞的玻片上面，然后将该玻片盖上盖玻片，移入真空干燥箱中进行梯度升温聚合：37摄氏度12小时，42摄氏度3小时，45摄氏度12小时，50摄氏度3小时。(5)激活激发光控荧光蛋白将所述树脂包埋的Hela细胞样品，用激活光405nm激光激活样品表层，然后用激发光504nm激光激发荧光并成像，激活光方向和激发光方向夹角为75°，即激活光方向与样品上表面方向夹角为15°，激活光激活处理前和激活处理后分别激发的荧光亮度如图12(图12A和图12B)所示。使用激光器激活激发PAGFP后，荧光亮度增加倍数显著，从几乎没有荧光到所有表达PAGFP的细胞都非常明亮，激活表层厚度为1～2um。(6)荧光显微断层成像表面成像完毕后，将样本移至金刚石刀具下进行切削，将已成像表面切削掉，露出新的表层，然后激活新表层的光控荧光蛋白并激发荧光成像，然后再重复“激活”、“成像”、“削除”的过程，如此反复断层成像直至获取整个样品的所有二维图像。所获取的二维图像自动配准获取样品的三维荧光图像，轴向分辨率达到了1～2um。实施例6荧光染料Alexa488标记的鼠脑层析成像。步骤如下：(1)将灌流后的鼠脑采用4％的PFA溶液进行固定和PBS溶液进行漂洗处理；(2)将固定和漂洗后的鼠脑组织用Alexa488进行免疫组化标记并采用PBS溶液进行漂洗处理；(3)将Alexa488标记的样本用100mMFeCl3水溶液进行淬灭处理20分钟，使Alexa488荧光基本全部淬灭；(4)将淬灭后的样本进行样本包埋处理，得到可用于成像的样本；(5)将样本固定于成像系统中，利用系统中的金刚石刀具将样品切削至待成像位置，将成像样品以及成像物镜前端浸入200mM的EDTA-Na4水溶液中，将成像焦面调节至样本表面。浸泡在EDTA-Na4水溶液中的样本，其表层荧光染料会被重新激活，表层被激活厚度0.5～1微米。荧光淬灭后和激活处理后分别激发的荧光亮度如图13所示。对荧光淬灭后的图像进行了对比度放大10倍的处理，如图13a所示，激活处理后，荧光强度(图13b)与激活前荧光强度对比度放大10倍后(图13a)的效果相当，即激活处理让荧光强度增强了10倍或以上，保证了其可用于进一步的成像。(6)用宽场成像的方式对样本表面进行成像，移动样品以获取样本整个表面的图像；(7)表面成像完毕后，将样本移至金刚石刀具下进行切削。将已成像表面切削掉以后，露出的新表面与碳酸钠溶液接触，新表面已淬灭的荧光得以恢复。(8)重复步骤(6)、(7)，获得一系列样本二维图像，得到的图像可进行重建处理，获得样本的三维荧光图样，轴向分辨率可达0.5～1微米。实施例7pH稳定荧光蛋白(非pH敏感荧光蛋白)DsRed标记的鼠脑样本的化学层析成像。步骤如下：(1)将荧光蛋白DsRed标记的小鼠脑组织用4％的PFA溶液进行固定和0.9％的NaCl溶液漂洗处理；(2)将固定和漂洗后的DsRed标记的样本用100mM的CuSO4溶液进行淬灭处理；(3)将淬灭后的样本进行样本包埋处理，得到可用于成像的样本；(4)将处理完毕后的DsRed标记的样本固定于成像系统中，利用系统中的金刚石刀具将样品切削至待成像位置，将成像样品以及成像物镜前端浸入200mM的EDTA-Na4水溶液中，将成像焦面调节至样本表面。浸泡在EDTA-Na4水溶液中的样本，其表层荧光蛋白会被重新激活；表层被激活厚度0.5～1微米。荧光淬灭后和激活处理后分别激发的荧光亮度如图14所示。对荧光淬灭后的图像进行了对比度放大100倍的处理，处理后的图像如图14a，样品经过淬灭处理后的荧光信号在强度放大100倍后才隐约可见，而经过再激活处理后(图14b)样品中荧光信号可以轻易的从背景中显现出来，背景很暗，对比度高，可用于进一步成像。(5)用宽场成像的方式对样本表面进行成像，移动样品以获取样本整个表面的图像；(6)表面成像完毕后，将样本移至金刚石刀具下进行切削。将已成像表面切削掉以后，露出的新表面与碳酸钠溶液接触，新表面已淬灭的荧光得以恢复。(7)重复步骤(5)、(6)，获得一系列样本二维图像，得到的图像可进行重建处理，获得样本的三维荧光图样，轴向分辨率为0.5～1微米。本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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