一种柑橘韧皮部汁液制备方法与流程

本发明涉及植物生理、病理，生物化学技术领域，尤其涉及一种柑橘韧皮部汁液制备方法。

背景技术：

柑橘类果树韧皮部在营养运输、信息传递和防御作用中发挥重要作用，韧皮部汁液中含有糖类、蛋白质、氨基酸、无机盐、多种RNAs及激素等，对于研究植物生理生化、营养和病理等方面具有重要的研究价值。传统的韧皮部汁液获取方法主要是蚜虫吻针法和伤流法。

蚜虫吻针法：利用昆虫口器——吻针收集韧皮部汁液的方法，刺吸性昆虫口器可以分泌果胶酶帮助其吻针刺入韧皮部筛管分子，当昆虫的吻针刺入筛管分子后，用CO2将其麻醉，切除母体而留下吻针。由于筛管正压力的存在，韧皮部汁液可以持续不断地从吻针流出，该收集韧皮部汁液方法多用于蔬菜和大田作物等多汁类植物，很少用于果树类植物，收集量少，操作难度高，重复性不好。

伤流法：用刀片切割植物的茎，收集从根侧茎中自然流出的汁液，该方法收集到的不但有韧皮部汁液，同时混有大量的木质部汁液和细胞液，并且很多植物通过该伤流法很难获得自然流出液。

技术实现要素：

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种柑橘韧皮部汁液制备方法，具体步骤如下：

(1)从树体剪取枝条，每株取3-5个枝条，密封袋标记保存；

(2)迅速将步骤(1)获得的样品枝条放入超低温冰箱冻存；

(3)内衬分离管的制备；

(4)外部支撑收集管的制备；

(5)从超低温冰箱中取出步骤(2)的样品枝条，用洁净剪刀去除枝条叶片，然后用灭菌去离子水将枝条外部冲洗干净，用无菌滤纸将表面的水拭去,本过程应在3-5分钟内完成；

(6)用无菌锋利的刀片把枝条树皮纵向划开，深达木质部，再将树皮与木质部分剥离开，去除木质部，保留带有韧皮部组织的树皮部分；

(7)用灭菌的剪刀或刀片将树皮切成小段，以5-10个小段为一束装入步骤(3)制备好的内衬分离管，再将内衬分离管置于步骤(4)制备好的外部支撑收集管中形成离心收集管，然后放置在冰上预冷；

(8)将步骤(7)制备好的离心收集管用冷冻离心机分离；

(9)离心完成后，弃掉内衬分离管，外部支撑收集管中的上清液即为柑橘韧皮部汁液；

(10)用无菌移液器吸头小心吸取外部支撑收集管中的上清液，转移到另一灭菌洁净冻存离心管中，并保存备用。

优选地，所述步骤(1)中的枝条长10-20cm，直径0.5cm。

优选地，所述步骤(2)中的超低温冰箱的温度为-70℃且冻存时间为2-6小时。

优选地，所述步骤(7)中切成的小段长度为0.6-1.0cm。

优选地，所述步骤(8)中冷冻离心机的工作条件：4℃，12000rpm×15min。

优选地，所述步骤(10)中的保存备用是放置在温度为-70℃的超低温冰箱内。

与已有技术相比，本发明有益效果体现在：

1、本技术方法所涉及的材料均为一般生物实验室方便易获得的通用材料，只需要做简单的改造或处理；本方法不但适用于温室或网室培养的柑橘苗木，也适用于田间栽培的各种成年柑橘树。

2、采样要求简单易行，枝条样品通过超低温冻融既保持样品的生物活性，又便于了枝条韧皮部和木质部易于分离，并可以提取收集到大量韧皮部汁液，不会受到木质部渗出液的影响。

3、利用制备的韧皮部汁液离心收集装置和高速低温离心(4℃，12000rpm×15min)，可以实现一步法分离得到韧皮部汁液并完全去除杂质，全过程在低温下进行保持了样品生物活性。

4、样品制备过程标准化，操作简单，主观影响因素少，可以大批量短时间处理样品，方便科学研究。

附图说明

图1为内衬分离管的结构示意图；

图2为外部支撑收集管的结构示意图；

图3为离心收集管的结构示意图；

图4为样品枝条的示意图；

图5内衬分离管装物示意图；

图6为离心收集汁液的状态图；

图中：1-内衬分离管、2-渗漏孔、3-外部支撑收集管、4-离心收集管、5-样品枝条、6-木质部、7-韧皮部。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例1

本发明提出了一种柑橘韧皮部汁液制备方法，具体步骤如下：

实验对象：温室培养的柑橘苗木(2年树龄)

(1)从树体剪取长10cm，直径0.5cm的枝条，每株取3个枝条，密封袋标记保存；

(2)迅速将步骤(1)获得样品枝条放入-70℃超低温冰箱冻存2小时；

(3)内衬分离管的制备：准备灭菌洁净的0.6ml离心管，离心管底部需要提前用无菌大号针头戳一个直径为1mm的圆形渗漏孔，剪去管盖；

(4)外部支撑收集管的制备：准备灭菌洁净的1.5ml离心管，使1.5ml离心管的管壁边缘刚好作为内衬分离管管口的支撑，并能套在内衬分离管外部；

(5)从超低温冰箱中取出步骤(2)的样品枝条，用洁净剪刀去除枝条叶片，然后用灭菌去离子水将枝条外部冲洗干净，用无菌滤纸将表面的水拭去，本过程应在3分钟内完成；

(6)用无菌锋利的刀片把枝条树皮纵向划开，深达木质部，再将树皮与木质部分剥离开，去除木质部，保留带有韧皮部组织的树皮部分；

(7)用灭菌的剪刀或刀片将树皮切成0.6cm的小段，以5个小段为一束装入步骤(3)制备好的内衬分离管，将装有样品的内衬分离管置于外部支撑收集管中形成离心收集管，然后把离心收集管置于冰上预冷；

(8)将步骤(7)制备好的离心收集管用冷冻离心机分离，离心工作条件：4℃，12000rpm×15min；

(9)离心完成后，弃掉内衬分离管，外部支撑收集管中的上清液即为柑橘韧皮部汁液；

(10)用无菌移液器吸头小心吸取外部支撑收集管中的上清液，转移到另一灭菌洁净冻存离心管中，并保存在-70℃的超低温冰箱内备用。

实施例2

本发明提出了一种柑橘韧皮部汁液制备方法，具体步骤如下：

实验对象：成年柑橘树(10年树龄)

(1)从树体剪取长20cm，直径0.5cm的枝条，每株取5个枝条，密封袋标记保存；

(2)迅速将步骤(1)获得样品枝条放入-70℃超低温冰箱冻存6小时；

(3)内衬分离管的制备：准备灭菌洁净的0.6ml离心管，离心管底部需要提前用无菌大号针头戳一个直径为1mm的圆形渗漏孔，剪去管盖；

(4)外部支撑收集管的制备：准备灭菌洁净的1.5ml离心管，使1.5ml离心管的管壁边缘刚好作为内衬分离管管口的支撑，并能套在内衬分离管外部；

(5)从超低温冰箱中取出步骤(2)的样品枝条，用洁净剪刀去除枝条叶片，然后用灭菌去离子水将枝条外部冲洗干净，用无菌滤纸将表面的水拭去，本过程应在5分钟内完成；

(6)用无菌锋利的刀片把枝条树皮纵向划开，深达木质部，再将树皮与木质部分剥离开，去除木质部，保留带有韧皮部组织的树皮部分；

(7)用灭菌的剪刀或刀片将树皮切成1.0cm的小段，以10个小段为一束装入步骤(3)制备好的内衬分离管，将装有样品的内衬分离管置于外部支撑收集管中形成离心收集管，然后把离心收集管置于冰上预冷；

(8)将步骤(7)制备好的离心收集管用冷冻离心机分离，离心工作条件：4℃，12000rpm×15min；

(9)离心完成后，弃掉内衬分离管，外部支撑收集管中的上清液即为柑橘韧皮部汁液；

(10)用无菌移液器吸头小心吸取外部支撑收集管中的上清液，转移到另一灭菌洁净冻存离心管中，并保存在-70℃的超低温冰箱内备用。

实施例3

本发明提出了一种柑橘韧皮部汁液制备方法，具体步骤如下：

实验对象：网室培养的柑橘苗木(4年树龄)

(1)从树体剪取长15cm，直径0.5cm的枝条，每株取4个枝条，密封袋标记保存；

(2)迅速将步骤(1)获得样品枝条放入-70℃超低温冰箱冻存4小时；

(3)内衬分离管的制备：准备灭菌洁净的0.6ml离心管，离心管底部需要提前用无菌大号针头戳一个直径为1mm的圆形渗漏孔，剪去管盖；

(4)外部支撑收集管的制备：准备灭菌洁净的1.5ml离心管，使1.5ml离心管的管壁边缘刚好作为内衬分离管管口的支撑，并能套在内衬分离管外部；

(5)从超低温冰箱中取出步骤(2)的样品枝条，用洁净剪刀去除枝条叶片，然后用灭菌去离子水将枝条外部冲洗干净，用无菌滤纸将表面的水拭去，本过程应在4分钟内完成；

(6)用无菌锋利的刀片把枝条树皮纵向划开，深达木质部，再将树皮与木质部分剥离开，去除木质部，保留带有韧皮部组织的树皮部分；

(7)用灭菌的剪刀或刀片将树皮切成0.8cm的小段，以7个小段为一束装入步骤(3)制备好的内衬分离管，将装有样品的内衬分离管置于外部支撑收集管中形成离心收集管，然后把离心收集管置于冰上预冷；

(8)将步骤(7)制备好的离心收集管用冷冻离心机分离，离心工作条件：4℃，12000rpm×15min；

(9)离心完成后，弃掉内衬分离管，外部支撑收集管中的上清液即为柑橘韧皮部汁液；

(10)用无菌移液器吸头小心吸取外部支撑收集管中的上清液，转移到另一灭菌洁净冻存离心管中，并保存在-70℃的超低温冰箱内备用。

以网室培养的柑橘苗木(4年树龄)为实验对象，分别使用本发明方法、蚜虫吻针法和伤流法获得柑橘韧皮部汁液，结果对比如下：

表1结果对比表

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。