本发明涉及抗体的检测领域，尤其涉及重组Neu蛋白检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法及其试剂盒。
背景技术：
副猪嗜血杆菌病（HP）能引起猪的多发性关节炎、浆膜炎、脑膜炎，常在仔猪保育阶段发病，死亡率可达50%。随着养猪业规模的迅速扩大和养猪模式的改变，近几年本病流行趋势日趋严重，给我国养猪业带来了巨大的经济损失，已成为危害养猪业最为严重的细菌性疾病之一。因此，快速、准确地诊断该病以便采取相应的措施，是成功预防和控制本病的关键。
目前，基层实验室对本病的诊断任停留在流行病学调查、临床症状和病理变化分析，结合细菌学诊断。然而，副猪嗜血杆菌与其他引起猪呼吸道疾病的临床症状非常相似，易混淆。已证实副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的常在菌，但临床上进行细菌分离鉴定时，其分离率较低，主要是该菌的分离培养易受抗生素或化学治疗剂等因素的影响，营养条件要求高，保存时间短。因此，传统的诊断技术已经不能满足现代猪病发展的需求，应用现代分子生物学技术及免疫学技术，找到一种检测或诊断副猪嗜血杆菌的候选抗原，建立一种快速、简便的诊断方法具有十分重要的意义。
现阶段，在众多副猪嗜血杆菌病的检测方法中，ELISA检测方法是应用最广、商品化最为成熟的一种检测方法；然而，目前市场仅有美国的Synbiocits公司生产检测本病的ELISA试剂盒，国内尚未生产检测本病的商品诊断试剂盒，该试剂盒采用HPS全菌作为包被抗原，存在潜在的散毒危险，且高昂的检测费用，每个血清样品检测费约60 RMB，使得众多养殖企业望而却步；另外，由于副猪嗜血杆菌血清型较多，各血清之间缺乏交叉保护，且各地流行菌株存在较大差异，若使用传统ELISA诊断方法包被细菌全菌，则该方法只对相同血清型细菌有很强诊断性，准确度很强，但对不同血清型菌株则诊断性明显降低，甚至出现大量假阴性和假阳性。因此，猪病检测市场急需经济、实效，且适用于大批次样品的商品化检测试剂盒。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：现有副猪嗜血杆菌病的ELISA检测方法采用HPS全菌作为包被抗原，存在潜在的散毒危险，且高昂的检测费用；此外，副猪嗜血杆菌血清型较多，各血清之间缺乏交叉保护，且各地流行菌株存在较大差异，使用传统ELISA诊断方法包被细菌全菌，只对相同血清型细菌有很强诊断性，对不同血清型菌株则诊断性明显降低，容易出现大量假阴性和假阳性。
针对上述技术问题，本发明提供的技术方案是：一种重组Neu蛋白检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法，其特征在于：采用副猪嗜血杆菌神经氨酸酶（Neuraminidase，Neu ）蛋白作为包被抗原。
对应于上述重组Neu蛋白检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法，其重组Neu蛋白检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：采用副猪嗜血杆菌神经氨酸酶（Neuraminidase，Neu ）蛋白作为包被抗原。
作为进一步说明，所述Neu蛋白的表达方式如下：
S1：以HPS 5型毒株为模板，通过PCR扩增获得Neu全基因，其Neu全基因编码为：NeuFP: ACGAATTCATGAAAAGAAGATTATCTAA，NeuRP: GCGTCGACTTACCAAGTATAACTGATATCTAC，并将其克隆至pMD18-T载体；
S2：再以pMD18-Neu基因为模板，重新设计引物，其引物编码为：NeuFp: GCGAATTCATGGGTATTGCAGCAACCA，NeuRP: GCGTCGACTTACCAAGTATAACTGATATCTAC，扩增得到HPS Neu蛋白的部分编码区，将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中，构建得到重组原核表达质粒pET-Neu。
S3：诱导培养500ml pET-Neu的转化菌Rosetta(DE3)，离心收菌、超声波裂解，并对包涵体进行提取。
S4：用SDS-PAGE对表达的Neu重组蛋白进行纯度检测，重组Neu蛋白的含量以Bradford检测法采用分光光度计测定。
作为进一步说明，所述间接ELISA操作程序如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将制备的抗原稀释至25ng/100μl至400ng/100μl，包被酶标板， 每孔100uL，轻振酶标板，使抗原在孔底均匀铺开，37℃作用2 h，转入4℃过夜吸附；
S2：次日用PBST洗涤液洗涤3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封闭，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗涤液洗板3～5次；
S4：加入用PBS稀释的待检血清，每孔100uL，同时设立阴阳性对照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀释的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鲜配制的OPD-H2O2 底物显色液，37 ℃避光显色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 终止液，每孔50uL终止反应；
S8：在酶标免疫测定仪上测定490nm波长下的OD值。
作为进一步优化，所述间接ELISA操作程序如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将制备的包被抗原稀释至25ng/100μl至400ng/100μl，包被酶标板， 每孔100uL，轻振酶标板，使抗原在孔底均匀铺开，37℃作用2 h，转入4℃过夜吸附；
S2：次日用PBST洗涤液洗涤3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封闭，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗涤液洗板3～5次；
S4：封闭后加样，每孔加入用PBS稀释的待检血清100uL，同时设立阴阳性对照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀释的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鲜配制的OPD-H2O2 底物显色液，37 ℃避光显色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 终止液，每孔50uL终止反应；
S8：在酶标免疫测定仪上测定450nm波长下的OD值。
作为进一步说明，所述血清的稀释比例为：1: 10至1:160。
作为进一步优化，所述Neu蛋白包被浓度为：100ng/100μl。
作为进一步优化，所述血清的稀释比例为1:160。
有益效果：通过上述重组Neu蛋白检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法，采用重组Neu蛋白作为包被，由于其Neu蛋白是所有血清型菌株都含有的重要蛋白，因此可对各血清型菌株进行检测，准确度会有明显提高，能较好的避免出现大量假阴性和假阳性；同时，通过采用重组Neu蛋白作为包被，能有效避免副猪嗜血杆菌病的ELISA检测存在散毒危险，并较大程度的降低检测成本。
此外，由于包被抗原的纯度和浓度是影响间接ELISA检测结果的关键因素，本发明中将制备的抗原用0.05mol/L PH9.6碳酸盐缓冲液包被，能防止液体培养基中丰富的蛋白成分与待检血清产生非特异性结合，造成结果的不准确；同时，并确定了抗原包被最佳浓度，提高了反应的灵敏度。
具体实施方式
下面将结合本发明内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种重组Neu蛋白检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法，采用副猪嗜血杆菌神经氨酸酶（Neuraminidase，Neu ）蛋白作为包被抗原；
其Neu 蛋白的表达方式如下：
S1：以HPS 5型毒株为模板，通过PCR扩增获得Neu全基因，其Neu全基因编码为：NeuFP: ACGAATTCATGAAAAGAAGATTATCTAA，NeuRP: GCGTCGACTTACCAAGTATAACTGATATCTAC，并将其克隆至pMD18-T载体；
S2：再以pMD18-Neu基因为模板，重新设计引物，其引物编码为：NeuFp: GCGAATTCATGGGTATTGCAGCAACCA，NeuRP: GCGTCGACTTACCAAGTATAACTGATATCTAC，扩增得到HPS Neu蛋白的部分编码区，将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中，构建得到重组原核表达质粒pET-Neu。
S3：诱导培养500ml pET-Neu的转化菌Rosetta(DE3)，离心收菌、超声波裂解，并对包涵体进行提取。
S4：用SDS-PAGE对表达的Neu重组蛋白进行纯度检测，重组Neu蛋白的含量以Bradford检测法采用分光光度计测定。
实施例一：
其重组Neu蛋白检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法的具体步骤如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将制备的抗原稀释至100ng/100μl，包被酶标板， 每孔100uL，轻振酶标板，使抗原在孔底均匀铺开，37℃作用2 h，转入4℃过夜吸附；
S2：次日用PBST洗涤液洗涤3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封闭，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗涤液洗板3～5次；
S4：加入用PBS稀释的待检血清，每孔100uL，同时设立阴阳性对照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀释的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鲜配制的OPD-H2O2 底物显色液，37 ℃避光显色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 终止液，每孔50uL终止反应；
S8：在酶标免疫测定仪上测定490nm波长下的OD值。
实施例二：
其重组Neu蛋白检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法的具体步骤如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将制备的抗原稀释至25ng/100μl，包被酶标板， 每孔100uL，轻振酶标板，使抗原在孔底均匀铺开，37℃作用2 h，转入4℃过夜吸附；
S2：次日用PBST洗涤液洗涤3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封闭，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗涤液洗板3～5次；
S4：封闭后加样，每孔加入用PBS稀释的待检血清100uL，同时设立阴阳性对照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀释的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鲜配制的OPD-H2O2 底物显色液，37 ℃避光显色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 终止液，每孔50uL终止反应；
S8：在酶标免疫测定仪上测定450nm波长下的OD值。
实施例三：
其重组Neu蛋白检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法的具体步骤如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将制备的抗原稀释至50ng/100μl，包被酶标板， 每孔100uL，轻振酶标板，使抗原在孔底均匀铺开，37℃作用2 h，转入4℃过夜吸附；
S2：次日用PBST洗涤液洗涤3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封闭，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗涤液洗板3～5次；
S4：封闭后加样，每孔加入用PBS稀释的待检血清100uL，同时设立阴阳性对照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀释的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鲜配制的OPD-H2O2 底物显色液，37 ℃避光显色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 终止液，每孔50uL终止反应；
S8：在酶标免疫测定仪上测定450nm波长下的OD值。
实施例四：
其重组Neu蛋白检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法的具体步骤如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将制备的抗原稀释至100ng/100μl，包被酶标板， 每孔100uL，轻振酶标板，使抗原在孔底均匀铺开，37℃作用2 h，转入4℃过夜吸附；
S2：次日用PBST洗涤液洗涤3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封闭，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗涤液洗板3～5次；
S4：封闭后加样，每孔加入用PBS稀释的待检血清100uL，同时设立阴阳性对照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀释的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鲜配制的OPD-H2O2 底物显色液，37 ℃避光显色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 终止液，每孔50uL终止反应；
S8：在酶标免疫测定仪上测定450nm波长下的OD值。
实施例五：
其重组Neu蛋白检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法的具体步骤如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将制备的抗原稀释至200ng/100μl，包被酶标板， 每孔100uL，轻振酶标板，使抗原在孔底均匀铺开，37℃作用2 h，转入4℃过夜吸附；
S2：次日用PBST洗涤液洗涤3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封闭，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗涤液洗板3～5次；
S4：封闭后加样，每孔加入用PBS稀释的待检血清100uL，同时设立阴阳性对照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀释的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鲜配制的OPD-H2O2 底物显色液，37 ℃避光显色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 终止液，每孔50uL终止反应；
S8：在酶标免疫测定仪上测定450nm波长下的OD值。
实施例六：
其重组Neu蛋白检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法的具体步骤如下：
S1：用0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将制备的抗原稀释至400ng/100μl，包被酶标板， 每孔100uL，轻振酶标板，使抗原在孔底均匀铺开，37℃作用2 h，转入4℃过夜吸附；
S2：次日用PBST洗涤液洗涤3～5次，每次5 min，拍干；
S3：然后用0.15% BSA封闭，每孔200uL，37 ℃作用1h，再用洗涤液洗板3～5次；
S4：封闭后加样，每孔加入用PBS稀释的待检血清100uL，同时设立阴阳性对照孔，37 ℃作用1h，洗板同上；
S5：加入稀释的SPA-HRP，23 ℃作用1h，洗板同上；
S6：加入新鲜配制的OPD-H2O2 底物显色液，37 ℃避光显色20min；
S7：加入2mol/LH2SO4 终止液，每孔50uL终止反应；
S8：在酶标免疫测定仪上测定450nm波长下的OD值。
通过上述实施例一至实施例六所建立的间接ELISA方法进行试验，其试验结果如下：
1、通过测定490nm波长下的OD值或测定450nm波长下的OD值，结果表明：在450nm波长下具有较佳的观察效果。
2、随机取用20份猪HP阴性血清样品，根据统计学原则，20份阴性样品平均OD450值(X)加上3倍标准差(S)即初步作为阴阳性的临界值，当样本的OD450nm大于等于这个数值时，可判为阳性，反之判为阴性；结果表明：X平均值= 0.2572，标准差S=0.0412，即当OD450nm≥0.3808时判为阳性，反之则为阴性。
3、通过上述实施例二至实施例六中不同的抗原包被稀释浓度的测试，实验结果表明：最佳抗原包被浓度为100ng/100μl。
4、取HP抗体阳性血清和抗体阴性血清，将HP阳性血清作1: 10，1: 20，1: 40，1:80，1:160稀释后，分别加入到酶标板的1，3，5，7，9列，HP阴性血清作同样处理加到酶标板的2，4，6， 8，10列，进行方阵滴定；兔抗猪酶标二抗以工作浓度进行稀释；检测结果表明：待检血清的最佳稀释度为1:160。
根据上述试验结果，对其间接ELISA方法进行反应条件优化，其优化的重组Neu蛋白检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法的具体步骤如下：
S1：将用包被液稀释的抗原加入酶标板内，100ng/100μl每孔, 37℃作用1小时后，置4℃冰箱24h。
S2：弃去孔内液体，用洗涤液洗3次，每次3分钟，最后用吸水纸拍干。
S3：各孔加入封闭液（50g/L脱脂奶粉溶液）200μl,37℃作用2小时。
S4：弃去孔内液体，用洗涤液洗2次，每次3分钟，最后用吸水纸拍干。
S5：加入待检血清，将待检血清用E.coli裂解上清稀释，室温感作30分钟，再以保温液作适当稀释，血清浓度为1:160，每孔100μl，37℃作用1小时。
S6：弃去孔内液体，用洗涤液洗2次，每次3分钟，最后用吸水纸拍干。
S7：加入酶标二抗，用保温液将酶标二抗按工作浓度稀释（1:15000），每孔100ul，37℃作用1h。
S8：弃去孔内液体，用洗涤液洗2次，每次3分钟，最后用吸水纸拍干。
S9：加底物，每孔100u1，37℃闭光作用10分钟。
S10：每孔加入50ul终止液终止反应并用酶标仪测定OD450值。
S11：判定结果，当OD450nm≥0.3808时判为阳性，反之则为阴性。