本发明属于物质检验测定
技术领域：
，具体涉及一种测定甘胆酸浓度的酶学比色方法及其试剂。
背景技术：
：甘胆酸(cholyglycine，cg)是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一。cg正常代谢途径为肠-肝循环，由肝细胞合成，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指肠，帮助食物消化。95％胆酸在回肠末端重吸收，经门静脉再回肝脏，由肝细胞摄取再利用。在血清中主要以蛋白结合形式存在，溢入体循环的总量小于1％。在正常情况下，外周血中胆酸含量甚微，血清cg浓度稳定在较低水平。当肝细胞受损时，肝细胞摄取cg能力下降，致使血中cg含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍，而返流血液循环的cg含量增高，也使血cg含量增高。因此，目前用ria(radioimmunoassay放射免疫测定法)法测定血清甘胆酸(scg)是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。正常人血清甘胆酸含量为1.3±0.8mg/l，范围可在0.4～2.98mg/l内波动，肝炎诊断低限值为＜3.18mg/l。各类肝炎、原发性肝癌、肝硬化患者血cg均明显高于正常人，且呈递性增高；胆石症伴黄疸患者胆管、胆囊排泄功能障碍可引起血清cg显著升高；肝硬化、梗阻性肝病、肠-肝循环障碍血清cg水平高于正常人。甘胆酸是妊娠晚期血清中最主要的胆汁酸组分。正常妊娠时孕妇血清cg水平随孕周逐步增高，至足月妊娠cg值较非孕时增加30％～60％。部分妊娠妇女血清cg值可出现生理性升高，临床上并没有明显的icp症状(妊娠期肝内胆汁淤积症)。随着cg值的升高程度不同，对母婴有着不同程度的损伤，且cg值越高危害越大。目前临床应用中，甘胆酸的全自动测定方法主要包括免疫比浊法和均相酶免疫法。两种方法由于无法获得不与其它胆汁酸交叉反应、高亲和力的单克隆抗体，故均存在重复性差，准确性差的方法学局限性，这主要是由于小分子抗体的特异性达不到要求所致。特别是在上述免疫学方法中，要获得足够特异的甘胆酸抗体，不与其它胆汁酸分子交叉，同时又要具有高亲和力，这样一种材料上的难度，局限了上述方法学的准确性，因此而制约了甘胆酸全自动针对试剂的推广应用。技术实现要素：本发明从根本上解决了免疫比浊法和均相酶免疫法的局限性。通过建立一种全新的酶学比色方法，该方法不存在免疫学方法中抗体材料制备的难度，从而解决了现有临床全自动试剂检测应用中存在的准确度低、抗干扰性能差的缺陷；并提供了一种基于本方法的测定甘胆酸浓度的试剂盒。采用本发明的试剂盒进行检测甘胆酸，可以像很多常规临床酶学方法一样，更易于操作和质量控制，并具有成本更低廉的优点，可实现临床快速、大流量的样本测试，使甘胆酸成为临床上常规检测项目成为可能，具有极高的科学和经济价值。本发明是通过以下全新的方法学和试剂技术方案解决上述问题的：本发明第一次公开了一种全新的酶学比色法应用于临床体液样本的甘胆酸含量测定，具体的，在试剂1加样本中，采用甘氨酸氧化酶和过氧化氢酶先排除样本中甘氨酸氧化酶底物的干扰；在试剂2中采用甘胆酸水解酶，水解甘胆酸为胆汁酸和甘氨酸，在甘氨酸氧化酶的作用下，采用过氧化物酶比色法，测定样本中甘胆酸的含量。采用本发明的方法，首次建立了一种全新的过氧化物酶比色法试剂盒应用于甘胆酸的测定，由于方法学中采用的专一性的酶，具有特异性强，准确度高，材料易购，方法学简单易用的特点。本发明提供了一种测定甘胆酸浓度的试剂盒，其中，较佳地，包括(1)、试剂1：由甘氨酸氧化酶、缓冲液、过氧化氢酶、抗坏血酸氧化酶、色原配体或色原、稳定剂和防腐剂组成；(2)、试剂2：由甘胆酸水解酶、缓冲液、过氧化物酶、色原或色原配体、稳定剂和叠氮钠组成。其中，所述的甘氨酸氧化酶、甘胆酸水解酶、过氧化氢酶和过氧化物酶可通过商业化公司获得，其它化剂均是普通化学试剂，市售均能获得。优选地，所述甘氨酸氧化酶为ec1.4.3.19，微生物来源，更优选地，选自枯草杆菌。所述甘氨酸氧化酶浓度较佳地为0.1～700ku/l，更佳地为2～300ku/l。甘氨酸氧化酶的用量下限应满足在5分钟之内，足够氧化样本中的甘氨酸。更优选地，在3分钟之内。优选地，所述过氧化氢酶浓度较佳地为0.5～10mu/l，更佳地为1～5mu/l，过氧化氢酶的用量下限应满足能完全分解甘氨酸氧化酶产生的过氧化氢。优选地，所述抗坏血酸氧化酶浓度较佳地为0.5～30ku/l，更佳地为1～10ku/l。优选地，所述甘胆酸水解酶为ec3.5.1.24，微生物来源。所述甘胆酸水解酶浓度较佳地为0.1～500ku/l，更佳地为2～100ku/l。甘胆酸水解酶的用量下限应满足在5分钟之内，足够水解样本中的甘胆酸，更优选地，在3分钟之内。优选地，所述过氧化物酶浓度较佳地为0.2～50ku/l，更佳地为1～10ku/l。优选地，所述的缓冲液为3-(n-吗啉基)-丙磺酸缓冲液、3-(n-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸缓冲液、tris缓冲液、bis-tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、n，n-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种或多种；所述的缓冲液的浓度较佳地为20～300mmol/l，更佳地为30～100mmol/l；所述的缓冲液的ph较佳地为6～9。优选地，所述色原可以采用单体色原化合物，如10-n-羟甲基氨甲酰基-3，7-二甲氨基-10h-吩噻嗪(ccap)、10-(n-甲氨基甲酰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪(mcdp)、双(3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基)胺(bcma)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二氢盐酸盐(tmbz)。优选地，色原浓度较佳地为0.01～50mm，更佳地为0.1～10mm。优选地，所述色原可以采用trinder’s色原化合物及其配体，如3-(n-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸(toos)、n-乙基-n-(3-磺丙基)苯胺(alps)、n-乙基-n-(3-甲基苯)-n-琥珀酰乙二胺(emse)、2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸(tbhba)；优选地，trinder’s色原浓度较佳地为0.1～100mm，更佳地为1～10mm。优选地，所述trinder’s色原配体可以采用4-氨基安替比林(4aa)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(mbth)、磺化3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(smbth)；优选地，trinder’s色原配体浓度较佳地为0.01～20mm，更佳地为0.1～10mm。优选地、所述的稳定剂选自0.05～1％牛血清白蛋白、0.05～1％吐温-20、0.05～1％tritonx-100、10～300mmol/l蔗糖、10～300mmol/l海藻糖、10～300mmol/l甘露糖、0.2～20mmol/ledta(乙二胺四乙酸)、10～200mm氯化钠、1～50mm氯化镁、0.1％～5％聚乙二醇和1％～10％乙二醇中的两种或两种以上；所述的百分比为质量百分比。临床检测试剂中稳定剂种类繁多，在试剂制备过程中，可不限于使用上述稳定剂。优选地，所述的防腐剂选自叠氮钠、proclin-300中的一种或两种，所述的防腐剂的质量百分比浓度为0.1％～1％。优选地，所述的试剂1的组成为：100mm/ltris缓冲液ph7.90、20ku/l甘氨酸氧化酶、4mu/l过氧化氢酶、5ku/l抗坏血酸氧化酶、0.3mm/lsmbth、50mm/l氯化钠、0.2％牛血清白蛋白、0.1％吐温-20、1mm/ledta、100mm/l甘露糖醇、和0.02％proclin-300；所述的百分比为质量百分比。优选地，所述的试剂2的组成为：100mm/ltris缓冲液ph7.50、50ku/l甘胆酸水解酶、2ku/l过氧化物酶、2mm/lalps、0.1％吐温-20、0.15％叠氮钠、100mmol/l甘露糖醇、50mm/l氯化钠、0.2％牛血清白蛋白、10mm硫酸镁和1mm/ledta；所述的百分比为质量百分比。其中，所述的测定甘胆酸浓度的试剂盒优选还包括试剂盒校准品和试剂盒质控品，所述的试剂盒校准品组成为：50μmol/l甘胆酸、50mmol/ltris缓冲液ph8.2、0.2％牛血清白蛋白、100mmol/l甘露糖醇、2mmol/ledta和0.15％proclin-300；所述的试剂盒质控品组成为：5μmol/l或50μmol/l甘胆酸、50mmol/ltris缓冲液ph8.2、0.2％牛血清白蛋白、100mmol/l甘露糖醇、2mmol/ledta和0.03％proclin-300；所述的百分比为质量百分比。本发明中，所述的试剂盒质控品可以用于随时检测试剂盒反应体系的可靠性。本发明还提供了一种测定甘胆酸浓度的方法，其包括下述步骤：将待测样品首先与试剂1混合，去除样品中甘氨酸氧化酶底物的干扰；再加入试剂2，试剂中的甘胆酸水解酶水解样本中的甘胆酸，生成胆汁酸和甘氨酸，甘氨酸经甘氨酸氧化酶氧化生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶显色系统的作用下显色，通过测定相应波长处吸光度的上升的程度，即可计算出待测样品中甘胆酸的含量。在r2试剂加入后，r1试剂中的过氧化氢酶被叠氮钠完全抑制，不会干扰反应。优选地，本发明还提供了一种疾病诊断或治疗目的的测定甘胆酸浓度的方法，其包括下述步骤：将待测体液样品首先与试剂1混合，去除样品中甘氨酸氧化酶底物的干扰；再加入试剂2，试剂中的甘胆酸水解酶水解样本中的甘胆酸，生成胆汁酸和甘氨酸，甘氨酸经甘氨酸氧化酶氧化生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶显色系统的作用下显色，通过测定相应波长处吸光度的上升的程度，即可计算出待测样品中甘胆酸的含量。在r2试剂加入后，r1试剂中的过氧化氢酶被叠氮钠完全抑制，不会干扰反应。本发明的试剂盒在全自动临床生化分析仪的应用中，待测样品首先与试剂1混合，在试剂1加样本中，采用甘氨酸氧化酶和过氧化氢酶先排除样本中甘氨酸氧化酶底物的干扰；在试剂2中采用甘胆酸水解酶，水解甘胆酸为胆汁酸和甘氨酸，在甘氨酸氧化酶的作用下，通过过氧化物酶比色法，测定样本中甘胆酸的含量。本发明的构思是在试剂1中采用甘氨酸氧化酶和过氧化氢酶，先消除样本中甘氨酸氧化酶底物的干扰，当加入试剂2时，试剂1中的过氧化氢酶被叠氮钠完全抑制，甘胆酸水解酶水解甘胆酸为胆汁酸和甘氨酸，在甘氨酸氧化酶的作用下，通过过氧化物酶比色法，测定样本中甘胆酸的含量。该构思首次提出了甘胆酸水解酶和甘氨酸氧化酶组成的甘胆酸测定体系，甘胆酸水解酶和甘氨酸氧化酶共同保证了测定的特异性和准确度。本发明公开的全新的检测方法及其试剂盒，可广泛应用于临床自动生化分析仪，从而达到广泛、快速、大批量规模应用的特点。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：(1)本发明的特点之一在于，提出了一种全新的由甘胆酸水解酶和甘氨酸氧化酶组成的酶学诊断体液样本中甘胆酸含量的方法，为甘胆酸的全自动检测提供了一个易于应用和普及的实用方法，不仅有效地排除了非特异性反应，而且提高了反应准确度和精密度。(2)本发明的另一特点之一在于，首次提供了一种完全的酶学检测方法试剂盒，应用于甘胆酸的临床检测，使甘胆酸的临床检测能够像普通酶学检测试剂一样具有更优的使用便利性和优良性能。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均能很容易地从相关商业公司购得。下述实施例中的百分比均是指质量百分比。实施例1：试剂1的制备：将下列物质依次按各浓度分别溶于纯水中，制得试剂1：100mm/ltris缓冲液ph7.9050mm/l氯化钠1mm/ledta20mm/l甘露糖醇0.02％proclin-3000.1％吐温-200.2％牛血清白蛋白4mu/l过氧化氢酶5ku/l抗坏血酸氧化酶20ku/l甘氨酸氧化酶0.3mm/l4-aa试剂2的制备：将下列物质依次按各浓度分别溶于纯水中，制得试剂2：100mm/ltris缓冲液ph7.500.15％叠氮钠100mmol/l甘露糖醇50mm/l氯化钠10mm硫酸镁1mm/ledta0.1％吐温-200.2％牛血清白蛋白2ku/l过氧化物酶50ku/l甘胆酸水解酶10mm/ltbhba实施例2：试剂1的制备：将下列物质依次按各浓度分别溶于纯水中，制得试剂1：100mm/ltris缓冲液ph7.90100mm/l氯化钠5mm/ledta100mm/l甘露糖醇0.02％proclin-3000.3％吐温-200.5％牛血清白蛋白5mu/l过氧化氢酶5ku/l抗坏血酸氧化酶50ku/l甘氨酸氧化酶0.2mm/lsmbth试剂2的制备：将下列物质依次按各浓度分别溶于纯水中，制得试剂2：100mm/ltris缓冲液ph7.500.15％叠氮钠100mmol/l甘露糖醇50mm/l氯化钠15mm硫酸镁2mm/ledta0.3％吐温-200.2％牛血清白蛋白2ku/l过氧化物酶100ku/l甘胆酸水解酶2mm/lalps实施例3：试剂1的制备：将下列物质依次按各浓度分别溶于纯水中，制得试剂1：50mm/l4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸缓冲液ph8.0050mm/l氯化钠2mm/ledta100mm/l甘露糖醇0.02％proclin-3000.1％tritonx-1000.2％牛血清白蛋白5mu/l过氧化氢酶5ku/l抗坏血酸氧化酶5ku/l甘氨酸氧化酶0.3mm/lccap试剂2的制备：将下列物质依次按各浓度分别溶于纯水中，制得试剂2：100mm/l4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸缓冲液ph8.000.15％叠氮钠100mmol/l甘露糖醇50mm/l氯化钠10mm硫酸镁1mm/ledta0.1％tritonx-1000.2％牛血清白蛋白2ku/l过氧化物酶8ku/l甘胆酸水解酶实施例4：甘胆酸校准品的制备在50mmtris缓冲液中依次加入0.2％牛血清白蛋白、100mm甘露糖醇、2mmedta、0.03％proclin-300和50μmol/l甘胆酸；用弱盐酸边搅拌、边调节ph至8.2。实施例5：甘胆酸质控品的制备在50mmtris缓冲液中依次加入0.2％牛血清白蛋白、100mm甘露糖醇、2mmedta、0.03％proclin-300和5μmol/l或50μmol/l甘胆酸；用弱盐酸边搅拌、边调节ph至8.2。实施例6：甘胆酸特异性验证用上述实施例1试剂，在2.4ml试剂1中分别加入0.3ml各为50μmol/l的胆汁酸、脱氧胆酸、牛胆酸、石胆酸、甘胆酸和纯水，混合均匀后，加入0.6ml试剂2，混匀后立刻在520nm处用分光光度计连续读取5分钟，结果如下：混匀后吸光度5分钟后吸光度水0.01030.0101胆汁酸0.01310.0127脱氧胆酸0.01020.0105牛胆酸0.01150.0122石胆酸0.01040.0109甘胆酸0.01270.1183由此可见，本发明采用的酶法对于甘胆酸具有极好的特异性，与其它常见胆汁酸没有反应。实施例7：甘胆酸特异性比较在日立7180全自动生化分析仪上，采用实施例2中的试剂，按r1∶s∶r2＝150∶20∶50，副波长/主波长＝660nm/546nm，15～34点读数区间的参数；与市售免疫比浊法试剂和均相酶免疫法试剂，各自采用各自的测定参数，同时测定分别为50μmol/l的胆汁酸、脱氧胆酸、牛胆酸、石胆酸、甘胆酸和纯水样品，结果如下：结果显示，本发明中的酶法试剂的检测特异性明显优于免疫比浊试剂和均相酶免疫试剂。实施例8：甘胆酸试剂检测重复性比较在日立7180全自动生化分析仪上，采用实施例3中的试剂，按r1∶s∶r2＝150∶8∶50，副波长/主波长＝800nm/660nm，15～34点读数区间的参数；与市售免疫比浊法试剂和均相酶免疫法试剂，各自采用各自的测定参数，同时测定一份临床标本15次，结果如下：实施例3试剂免疫比浊法试剂均相酶免疫法试剂38.7743.6649.3238.7745.7647.6538.7143.1549.1138.7340.3849.0038.7545.8747.3138.7544.3647.8638.7748.8148.1238.3643.2947.7838.7043.2948.9838.7046.3947.3238.7145.7546.4938.7845.0348.5038.7942.9447.3238.9344.3149.0138.7440.2348.67平均数38.7344.2148.16相对偏差0.302％5.035％1.767％结果显示，本发明中的酶法试剂的检测精密度明显优于免疫比浊试剂和均相酶免疫试剂。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不构成对权利要求范围的限制，本领域技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护范围内。当前第1页12