可实现GLT‑1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法与流程

本发明涉及一种可实现谷氨酸转运体-1蛋白鉴定及绝对定量的检测试剂盒及测定方法，属于检验测定技术领域。

背景技术：

谷氨酸是中枢神经系统内兴奋性神经递质，当它被释放到突触间隙后，谷氨酸转运体-1能逆浓度梯度从胞外向胞内摄取谷氨酸，使突触间隙内谷氨酸浓度保持在较低水平，以保护神经元不受谷氨酸的兴奋性毒性影响。突触间隙中95％谷氨酸的摄取由星形胶质细胞膜上的谷氨酸转运体-1(glutamate transporter-1/excitatory amino acid transporter 2，GLT-1/EAAT2)完成，谷氨酸转运体-1对清除突触间隙中的谷氨酸，终止谷氨酸能神经传递发挥主要作用。谷氨酸转运体-1分子量为73kDa，含573个氨基酸，有8～9个跨膜片段。国内外检测谷氨酸转运体-1蛋白的主要方法有酶联免疫吸附测定法(ELISA)和蛋白印迹法(western blot)。ELISA法有特异性强的优点，但有易污染、背景值高的缺点；western blot法为蛋白半定量方法，并且检测时间较长，这些方法常使检测灵敏度降低，不适合痕/微量谷氨酸转运体-1蛋白的检测。

技术实现要素：

技术问题：本发明的目的是提供一种谷氨酸转运体-1蛋白检测试剂盒，给出一种采用本试剂盒可以克服现有技术缺点的谷氨酸转运体-1蛋白的定性鉴别和绝对定量的方法。该试剂盒给出了检测谷氨酸转运体-1蛋白的标准物质和对含谷氨酸转运体-1蛋白样品进行酶解反应的反应试剂。可将标准物质和/或酶解反应产物(或含内标物质)注入(超)高效液相色谱-三重四级杆质谱仪中进行谷氨酸转运体-1蛋白鉴定及含量测定。本发明提供了一种专属性强、精密度高、结果准确可靠、操作简便，可用于样品中谷氨酸转运体-1蛋白鉴定及含量测定的一种检测试剂盒及检测方法。

技术方案：

一种可实现GLT-1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：包括标准物质：

标准物质包括特征肽段及其内标肽段，肽段序列为：

选择方式如下：

(1)、所述标准物质的特征肽段单独使用或者与其他特征肽段配成两种混合特征肽段使用；

(2)、内标肽段单独使用，或与其他特征肽段配成两种或多种混合内标物质使用；

(3)、所述标准物质的特征肽段与其内标肽段配成的单一内标物质单独使用，或与另外一种单一内标物质同时使用；

(4)内标肽段与其他内标肽段混合使用。

该试剂盒还包括反应试剂：

反应试剂，由以下成分组成

所述标准物质的内标肽段是特征肽段中任一、二或多个氨基酸上的C、H、O、N被同位素标记后的肽段，其中，一个氨基酸上的C、H、O、N四个元素可同时被标记，或任意1～3个元素被标记。

所述标准物质配成单剂、双剂或多剂。

所述胰蛋白酶为序列级胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一种。

所述反应试剂配成单剂。

1)标准物质

①标准物质是特征肽段，是单一标准物质，或配成多混合标准物质，使用其中的一种或多种；

单一标准物质I

特征肽段1 VTLAANGK

单一标准物质II

特征肽段2 TQSIYDDK

双混合标准物质

特征肽段1 VTLAANGK

特征肽段2 TQSIYDDK

②内标肽段，是单一内标肽段，或配成多混合内标肽段，使用其中的一种或多种；

单一内标肽段I

内标肽段1 VTLAANGK

单一内标肽段II

内标肽段2 TQSIYDDK

双混合内标肽段

内标肽段1 VTLAANGK

内标肽段2 TQSIYDDK

③将上述特征肽段与其内标肽段联合使用，是单一内标物质，或配成混合内标物质，使用其中的一种或多种；

单一内标物质I

特征肽段1 VTLAANGK

内标肽段1 VTLAANGK

单一内标物质II

特征肽段2 TQSIYDDK

内标肽段2 TQSIYDDK

混合内标物质I

特征肽段1 VTLAANGK

特征肽段2 TQSIYDDK

内标肽段1 VTLAANGK

混合内标物质II

特征肽段1 VTLAANGK

特征肽段2 TQSIYDDK

内标肽段2 TQSIYDDK

混合内标物质III

④标准物质是单剂、或是双剂或多剂，根据上述方法自由组合或选择其中的一种或多种。

利用上述的可实现GLT-1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒所实施的谷氨酸转运体-1蛋白含量测定方法，其特征在于：该方法步骤如下：

(1)将待测样品加入碳酸氢铵，涡旋，加入二硫苏糖醇，温育振荡，再加入碘乙酰胺，温育振荡，放置至室温后，再加入胰蛋白酶，温育振荡，最后加入甲酸终止反应；

(2)将标准物质和(1)步骤中最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联四极杆质谱仪中检测，或将内标物质和(1)步骤中含内标肽段的最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中检测，检测后通过母离子和子离子的质荷比(m/z)及特征肽段的保留时间(t_R)进行定性鉴别，色谱峰峰面积变化测算出谷氨酸转运体-1蛋白的绝对含量；

温度控制在25～60℃范围，温育时间控制在0.5～12h，振荡频率控制在800～2500rmp，涡旋时间控制在2～10min，室温控制在18-22℃范围；

胰蛋白酶与被测样品总蛋白量比例控制在1/1到1/100。

所述步骤(2)为：将特征肽段和(1)步骤中最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪中检测，或将混合内标物质和(1)步骤中含内标肽段的最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中检测，通过m/z和t_R进行定性，色谱峰峰面积变化测算出谷氨酸转运体-1蛋白的含量。

有益效果：本发明具有的有益效果为：本发明提供的检测试剂盒和检测方法能对样品中谷氨酸转运体-1蛋白进行准确灵敏的定性和绝对定量，具有特异性强、灵敏度高、结果准确、操作简便等优点。

本发明包括标准物质(由特征肽段及其内标肽段组成)和反应试剂；采用(超)高效液相色谱-三重四级杆质谱仪进行检测，这是一类采用高效液相色谱分离，三重四级杆质谱检测母离子和子离子m/z的设备，能快速、精确、灵敏的对脑组织中谷氨酸转运体-1蛋白进行定性鉴别和绝对定量。该方法具有操作简便、特异性强、灵敏度和准确度高的特点。

目前，尚未开发出测定谷氨酸转运体-1蛋白含量的特征肽段及其内标肽段和反应试剂的试剂盒。本发明成功的弥补了生物检测领域的不足，能准确地对脑中谷氨酸转运体-1蛋白进行定性鉴别及绝对定量，具有特异性强、操作简便、灵敏度和准确度高的优点。

附图说明

图1为特征肽段1的二级质谱图(m/z＝387.2)

图2为特征肽段1的二级质谱图(m/z＝485.2)。

具体实施方式

通过以下实施例进一步说明本发明，但本发明的权利要求不仅限于实施例。

本发明包括谷氨酸转运体-1蛋白检测试剂盒和含量测定方法两部分。

谷氨酸转运体-1蛋白检测试剂盒由标准物质和反应试剂两部分组成：

1)标准物质

①用以实现本发明试剂盒的标准物质是特征肽段，可以是单一标准物质，或配成多混合标准物质，可使用其中的一种或多种。

单一标准物质I

特征肽段1 VTLAANGK

单一标准物质II

特征肽段2 TQSIYDDK

双混合标准物质

特征肽段1 VTLAANGK

特征肽段2 TQSIYDDK

②用以实现本发明试剂盒的内标肽段，可以是单一内标肽段，或配成多混合内标肽段，可使用其中的一种或多种。

单一内标肽段I

内标肽段1 VTLAANGK

单一内标肽段II

内标肽段2 TQSIYDDK

双混合内标肽段

内标肽段1 VTLAANGK

内标肽段2 TQSIYDDK

③将上述特征肽段与其内标肽段联合使用，以下简称“内标物质”，更有利于谷氨酸转运体-1蛋白的定性和定量检测。可以是单一内标物质，或配成混合内标物质，可使用其中的一种或多种。

单一内标物质I

特征肽段1 VTLAANGK

内标肽段1 VTLAANGK

单一内标物质II

特征肽段2 TQSIYDDK

内标肽段2 TQSIYDDK

混合内标物质I

特征肽段1 VTLAANGK

特征肽段2 TQSIYDDK

内标肽段1 VTLAANGK

混合内标物质II

特征肽段1 VTLAANGK

特征肽段2 TQSIYDDK

内标肽段2 TQSIYDDK

混合内标物质III

④用以实现本发明方法的谷氨酸转运体-1蛋白检测试剂盒中的标准物质可以是单剂、也可以是双剂或多剂，可根据上述方法自由组合或选择其中的一种或多种。

2)反应试剂，用以实现本发明方法的反应试剂是单剂，包括：

本发明测定谷氨酸转运体-1蛋白含量的步骤如下：

(1)将样品制成的组织匀浆液(或含内标肽段)，离心，取上清液，加入碳酸氢铵，涡旋，加入二硫苏糖醇，温育振荡，再加入碘乙酰胺，温育振荡，放置至室温后，再加入胰蛋白酶，温育振荡，最后加入甲酸终止反应。

(2)将标准物质和最终产物(或含内标肽段)分别注入(超)高效液相色谱-三重四级杆质谱仪中检测，通过m/z及t_R进行定性鉴别，色谱峰峰面积变化测算出样品中谷氨酸转运体-1蛋白的含量。

通常步骤(1)温育温度控制在25～60℃范围，温育时间控制在0.5～12h，振荡频率控制在800～2500rmp，胰蛋白酶与被测样品总蛋白量比例控制在1/1到1/100，涡旋时间控制在2～10min。

所述步骤(2)将特征肽段(一种或两种)和最终产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四级杆质谱仪中检测，或将混合内标物质(一种或两种)和最终产物(含内标肽段)分别注入(超)高效液相色谱-三重四级杆质谱仪中检测，通过m/z及t_R进行定性鉴别，通过色谱峰峰面积变化，采用内标法或外标法测算出样品中谷氨酸转运体-1蛋白的含量。

实施例1：

样品：小鼠大脑组织

混合内标物质I

特征肽段1 VTLAANGK

特征肽段2 TQSIYDDK

内标肽段1 VTLAANGK

单一内标肽段I：

内标肽段1 VTLAANGK

(1)样品的制备：取小鼠大脑组织50mg，加入1ml细胞裂解液，超声破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入单一内标肽段I，混匀，离心。取上清液，加200mmol/L碳酸氢铵溶液400μL，涡旋(1000rmp)5min，加入100mmol/L二硫苏糖醇溶液200μL，55℃温育振荡(1000rmp)60min，放置至室温后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液400μL，30℃温育振荡(1000rmp)30min，加入10.0mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，50℃温育振荡(1000rmp)60min，放置至室温后，加入10％甲酸水溶液100μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终产物。

(2)将混合内标物质I和最终产物(含单一内标肽段I)分别注入(超)高效液相色谱-三重四级杆质谱仪中检测，通过m/z及t_R进行定性鉴别，特征肽段1采用内标法进行定量，特征肽段2作为佐证肽段可采用外标法进行定量。特征肽段1和2的检出限均为3ng，回收率为85.1％～97.1％(n＝6)。

实施例2：

样品：大鼠大脑组织

单一标准物质I

特征肽段1 VTLAANGK

单一标准物质II

特征肽段2 TQSIYDDK

单一内标肽段II：

内标肽段2 TQSIYDDK

1)样品的制备：取大鼠大脑组织50mg，加入1ml细胞裂解液，超声破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入单一内标肽段II，混匀，离心。取上清液，加入100mmol/L碳酸氢铵溶液800μL，涡旋(1200rmp)4min，加入150mmol/L二硫苏糖醇溶液200μL，60℃温育振荡(1200rmp)45min，放置至室温后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃温育振荡(1200rmp)40min，加入2.0mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，60℃振荡(1500rmp)温育60min，放置至室温后，加入20％甲酸水溶液50μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终产物。

2)将单一标准物质I和II与单一内标肽段II混合后，与最终酶解产物(含单一内标肽段II)分别注入(超)高效液相色谱-三重四级杆质谱仪中检测，通过m/z及t_R进行定性鉴别，特征肽段2采用内标法进行定量，特征肽段1作为佐证肽段可采用外标法进行定量。特征肽段1和2的检出限均为3ng，回收率为86.3％～95.8％(n＝6)。

实施例3：

样品：大鼠脑星形胶质细胞

双混合标准物质

特征肽段1 VTLAANGK

特征肽段2 TQSIYDDK

1)样品的制备：取大鼠星形胶质细胞100mg，加入1ml细胞裂解液，超声破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入100mmol/L碳酸氢铵溶液800μL，涡旋(1000rmp)3min，加入150mmol/L二硫苏糖醇溶液60μL，65℃温育振荡(1200rmp)35min，放置至室温后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃温育振荡(1000rmp)40min，加入10mg/ml胰蛋白酶溶液100μL，35℃温育振荡(1500rmp)12h，放置至室温后，加入20％甲酸水溶液50μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。

2)将双混合标准物质和最终产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四级杆质谱仪中检测，通过m/z及t_R进行定性鉴别，采用外标法定量。特征肽段1和2检出限为2ng，回收率为93.7％～98.4％(n＝6)。

实施例4：

样品：大鼠海马组织

单一内标物质II

特征肽段2 TQSIYDDK

内标肽段2 TQSIYDDK

单一内标肽段II：

内标肽段2 TQSIYDDK

1)样品的制备：取大鼠海马组织50mg，加入1ml细胞裂解液，超声破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入单一内标肽段II，混匀，离心，取上清液，加入100mmol/L碳酸氢铵溶液850μL，涡旋(800rmp)9min，加入200mmol/L二硫苏糖醇溶液100μL，60℃温育振荡(2000rmp)100min，放置至室温后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃温育振荡(2500rmp)20min，加入8mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，60℃振荡(1500rmp)温育30min，放置至室温后，加入15％甲酸水溶液300μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终产物。

2)将单一内标物质II和最终产物(含单一内标肽段II)分别注入(超)高效液相色谱-三重四级杆质谱仪中检测，通过m/z及t_R进行定性鉴别，采用内标法定量。检出限为2ng，回收率为89.1～98.7％(n＝6)。

实施例5：

样品：小鼠大脑皮层

混合内标物质III

双混合内标肽段

内标肽段1 VTLAANGK

内标肽段2 TQSIYDDK

1)样品的制备：取小鼠大脑皮层50mg，加入1ml细胞裂解液，超声破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入双混合内标肽段，混匀，离心，取上清液，加入100mmol/L碳酸氢铵溶液800μL，涡旋(1000rmp)6min，加入100mmol/L二硫苏糖醇溶液400μL，60℃温育振荡(1200rmp)45min，放置至室温后，加入120mmol/L碘代乙酰胺溶液200μL，25℃温育振荡(1000rmp)50min，加入5mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，35℃温育振荡(1800rmp)12h，放置至室温后，加入10％甲酸水溶液500μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终产物。

2)将混合内标物质III和最终产物(含双混合内标肽段)分别注入(超)高效液相色谱-三重四级杆质谱仪中检测，通过m/z及t_R进行定性鉴别，采用特征肽段1和2采用内标法定量。特征肽段1检出限为3ng，特征肽段2检出限为2ng，回收率为86.7％～95.2％(n＝6)。

实施例6：

样品：小鼠脑星形胶质细胞

混合内标物质II

特征肽段1 VTLAANGK

特征肽段2 TQSIYDDK

内标肽段2 TQSIYDDK

单一内标肽段II

内标肽段2 TQSIYDDK

1)样品的制备：取小鼠脑星形胶质细胞100mg，加入1ml细胞裂解液，超声破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入单一内标肽段II，混匀，离心，取上清液，加入130mmol/L碳酸氢铵溶液800μL，涡旋(1000rmp)6min，加入200mmol/L二硫苏糖醇溶液200μL，60℃温育振荡(1200rmp)50min，放置至室温后，加入120mmol/L碘代乙酰胺溶液250μL，25℃温育振荡(1000rmp)60min，加入10mg/ml胰蛋白酶溶液50μL，60℃温育振荡(1800rmp)100min，放置至室温后，加入10％甲酸水溶液160μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终产物。

2)将混合内标物质II和最终产物(含单一内标肽段II)分别注入(超)高效液相色谱-三重四级杆质谱仪中检测，通过m/z及t_R进行定性鉴别，特征肽段2采用内标法定量，特征肽段1作为佐证肽段可采用外标法定量。特征肽段1和2的检出限为3ng，回收率为85.7％～95.2％(n＝6)。

以上实施例中：标准物质特征肽段单独使用或与其他特征肽段配成两种混合标准物质使用，具体实施方式不再一一赘述。

标准物质特征肽段与其内标肽段配成的混合内标物质，单独使用或与另外一种特征肽段或混合内标物质同时使用，具体实施方式不再一一赘述。

标准物质配成单剂、双剂或多剂，具体实施方式不再一一赘述。

所述胰蛋白酶为序列级胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一种。

总之，上述替换的实施例在这里不做赘述。

总之，实验证明，采用本发明的检测试剂盒完全可以对样品中谷氨酸转运体-1蛋白进行鉴定，并得出所需的绝对含量测定结果，并且灵敏度高、特异性好、精密度高、不受内、外源物质的污染。

本发明的检测试剂盒及检测方法具有专属性强、精密度高、结果准确可靠、操作简便等优点，可用于样品中谷氨酸转运体-1蛋白含量测定。

蛋白序列

谷氨酸转运体-1蛋白

MASTEGANNMPKQVEVRMHDSHLSSDEPKHRNLGMRMCDKLGKNLLLSLTVFGVILGAVCGGLLRLASPIHPDVVMLIAFPGDILMRMLKMLILPLIISSLITGLSGLDAKASGRLGTRAMVYYMSTTIIAAVLGVILVLAIHPGNPKLKKQLGPGKKNDEVSSLDAFLDLIRNLFPENLVQACFQQIQTVTKKVLVAPPSEEANTTKAVISMLNETMNEAPEETKIVIKKGLEFKDGMNVLGLIGFFIAFGIAMGKMGEQAKLMVEFFNILNEIVMKLVIMIMWYSPLGIACLICGKIIAIKDLEVVARQLGMYMITVIVGLIIHGGIFLPLIYFVVTRKNPFSFFAGIFQAWITALGTASSAGTLPVTFRCLEDNLGIDKRVTRFVLPVGATINMDGTALYEAVAAIFIAQMNGVILDGGQIVTVSLTATLASIGAASIPSAGLVTMLLILTAVGLPTEDISLLVAVDWLLDRMRTSVNVVGDSFGAGIVYHLSKSELDTIDSQHRMQEDIEMTKTQSIYDDKNHRESNSNQCVYAAHNSVVIDECKVTLAANGKSADCSVEEEPWKREK

谷氨酸转运体-1蛋白

MASTEGANNMPKQVEVRMHDSHLSSDEPKHRNLGMRMCDKLGKNLLLSLTVFGVILGAVCGGLLRLASPIHPDVVMLIAFPGDILMRMLKMLILPLIISSLITGLSGLDAKASGRLGTRAMVYYMSTTIIAAVLGVILVLAIHPGNPKLKKQLGPGKKNDEVSSLDAFLDLIRNLFPENLVQACFQQIQTVTKKVLVAPPSEEANTTKAVISMLNETMNEAPEETKIVIKKGLEFKDGMNVLGLIGFFIAFGIAMGKMGEQAKLMVEFFNILNEIVMKLVIMIMWYSPLGIACLICGKIIAIKDLEVVARQLGMYMITVIVGLIIHGGIFLPLIYFVVTRKNPFSFFAGIFQAWITALGTASSAGTLPVTFRCLEDNLGIDKRVTRFVLPVGATINMDGTALYEAVAAIFIAQMNGVILDGGQIVTVSLTATLASIGAASIPSAGLVTMLLILTAVGLPTEDISLLVAVDWLLDRMRTSVNVVGDSFGAGIVYHLSKSELDTIDSQHRMQEDIEMTKTQSIYDDKNHRESNSNQCVYAAHNSVVIDECKVTLAANGKSADCSVEEEPWKREK