利用分子印迹膜电喷雾电离质谱分析待测样本中痕量物质的方法与流程

本发明涉及分子印迹膜电喷雾电离质谱(molecularlyimprintedmembraneelectrosprayionizationmassspectrometry,mim-esi-ms)的开发与应用，具体地说，涉及分子印迹膜电喷雾电离质谱的工作流程，以及该技术在多个领域中的应用，例如在食品安全、血药浓度、抗生素残留及农药残留的实际待测样本的快速检测。

背景技术：

质谱(massspectrometry,ms)是一种强大的分析工具，具有高灵敏度，高分辨率，样本分析用量小等优势，被广泛应用在不同的领域中。近年来，敞开式电离技术(ambientionization,am)成为研究热点并不断发展，该技术缩短或者避免了复杂样本的前处理过程，使应用质谱技术快速检测复杂样本成为可能。常见的敞开式电离技术包括：解析电喷雾电离(desi)，实时直接分析质谱(dart)，纸喷雾电离(ps)和膜电喷雾电离(mesi)等。

mesi是申请人先前开发的新型敞开式质谱离子化技术。该技术将生物膜结合质谱离子源，可在样本分析过程中实现实时的三维分离，有效地消除基质干扰，较常规方法极大地提高了检测灵敏度。尽管，膜电喷雾电离技术具有上述优势，然而在分析复杂样本中痕量待测物质时，期待获得更低的检出限和更宽的动态范围仍然具有挑战性。

为了进一步提升mesi的性能，拟将其与分离富集技术相结合，开发出新型的敞开式离子化技术。目前常见的分离富集方法多种多样，如固相微萃取、分子印迹等，其应用都已被广泛报道。其中，分子印迹是采用分子印迹聚合物(molecularimprintingpolymer,mip)，对待测物质进行特异性富集的策略。mip是一种利用模板分子和功能单体通过共价键或非共价键结合形成的聚合物，洗脱出去模板分子后，留下对某种特定的模板分子及其类似物具有选择识别性的空穴。其中，伪模板分子是指和模板分子具有类似的识别或者印迹位点、相似的分子大小和形状，洗脱除去伪模板分子后，形成的空穴仍然具有选择识别性。

技术实现要素：

为了解决敞开式电离技术无法满足在保证高灵敏度的前提下快速定性定量分析的问题，本发明提供一种具有高灵敏度且无需样本前处理的新型敞开式电离技术，分子印迹膜电喷雾电离技术(mim-esi)，应用于食品安全、血药浓度、抗生素残留和农药残留。

本发明首先提供一种微滤膜表面修饰与活化的方法，包括以下步骤：

1)将微滤膜浸入碱溶液中，55-65℃处理后，用纯水清洗膜表面；

2)再将步骤1)得到的膜浸入含有丙烯酸和过硫酸钾的水溶液中，脱氧后，65-75℃下恒温反应；

3)最后将步骤2)得到的微滤膜依次浸入纯水、乙腈、0.15mol·l^-1aibn乙腈溶液中，挥干溶剂后将膜立即进入分子印迹反应液中。

本发明所述的微滤膜包括但不限于pvdf膜、ptfe膜或纤维素膜。

本发明的微滤膜表面修饰与活化的方法中，步骤1)中碱溶液为3％naoh水溶液；55-65℃处理时间为10-15h，优选地，60℃处理12h。

本发明的微滤膜表面修饰与活化的方法中，步骤2)中将膜进去含有10％丙烯酸和1％过硫酸钾的水溶液中，脱氧；65-75℃氮气环境下恒温反应4-6h，优选地，70℃氮气环境下恒温反应5h。

本发明提供一种利用分子印迹膜电喷雾电离质谱法分析待测样本中痕量物质的方法，包括以下步骤：

1)按照上述方法进行微滤膜的表面修饰与活化；

2)合成分子印迹膜：将经表面修饰与活化后的微滤膜浸入含有模板分子、功能单体、交联剂和引发剂的分子印迹反应液中，脱氧，氮气环境下恒温聚合；所述模板分子根据待测分子选择类似物质；所述反应溶剂为氯仿和/或甲醇；

3)洗脱模板分子：将步骤2)中得到的分子印迹膜浸入洗脱溶剂中以除去模板分子；

4)将除去模板分子的分子印迹膜浸入待测样本中，取出，采用分子印迹膜电喷雾电离装置对分子印迹膜进行检测。

在本发明的一个实施例中，上述方法用于检测待测样本中的抗生素残留。

本发明提供的利用分子印迹膜电喷雾电离质谱法直接快速分析待测样本中的抗生素残留的方法的步骤2)中，模板分子为诺氟沙星(nflx)，功能单体为maa，交联剂为egdma，引发剂为aibn，nflx与maa、egdma比例为1:4:10。步骤2)中，反应溶液为氯仿：甲醇(v:v＝5:1)，溶液体积以能够充分溶解前四种物质(nflx、maa、egdma、aibn)为宜。

进一步地，步骤2)中，具体操作为：首先，用反应溶剂充分溶解模板分子，然后加入功能单体，室温下预聚合1h；再加入交联剂和引发剂，溶解后加入经表面修饰和活化的pvdf膜，脱氧，室温下反应1-3h。

更进一步地，步骤2)在室温下反应1-3h后，将膜移到氮气环境下恒温60℃反应24h；反应结束后，按照步骤3)洗脱除去模板分子，再用纯水洗涤至中性，接着用丙酮洗脱并挥干，储存在干燥器中备用。

步骤3)的具体操作为：摇晃0.5-1h，更换溶剂重复数次，除去模板分子。所述洗脱溶剂为乙酸和甲醇；洗脱时间0.5-1h，更换溶剂重复数次，优选地，室温下30min洗脱，共重复4次。

步骤4)所述待测样本为液体，或当待测样本为固体时，用适宜溶剂溶解，使之成为液体。发明人发现，步骤4)，即，将分子印迹膜加至待测样本的液体体系中，结合率-时间大致情况为5-15min线性上升，15-30min上升缓慢，30-60min接近平衡。因此，优选地，步骤4)吸附摇晃时间为10-30min，更优选地，时间为20min。

本发明还提供了上述方法在食品安全领域中的应用，检测模拟生物样本中的瘦肉精盐酸克伦特罗，特别说明，根据不同待测分子，相对应的分子印迹膜的模板分子选择不同，与功能单体和交联剂的摩尔比不同，以及选用反应溶剂不同。

本发明还提供了上述方法在血药浓度检测中的应用，检测模拟生物样本中的甲氨蝶呤，特别说明，根据不同待测分子，相对应的分子印迹膜的模板分子选择不同，与功能单体和交联剂的摩尔比不同，以及选用反应溶剂不同。

本发明还提供了上述方法在土壤样本中农药残留的检测，检测模拟生物样本中的毒死蜱，特别说明，根据不同待测分子，相对应的分子印迹膜的模板分子选择不同，与功能单体和交联剂的摩尔比不同，以及选用反应溶剂不同。

利用本发明的方法可实现在食品安全、血药浓度、抗生素残留和农药残留的快速实时定性、定量分析。除上述四个应用外，本发明的方法可以根据待测物质的性质设计相对应的分子印迹膜，以满足分析，故本发明方法有广阔应用前景。

在本发明的实施例中，提供了利用分子印迹膜电喷雾电离质谱法在食品安全：瘦肉精盐酸克伦特罗；血药浓度：甲氨蝶呤；抗生素残留：环丙沙星和农药残留：毒死蜱的定性、定量检测方法，其包括如下步骤：

1)合成以莱克多巴胺、甲氧苄氨嘧啶、诺氟沙星和甲基立枯磷为模板合成的分子印迹膜，并且洗脱除去分子印迹膜上的模板分子；

2)分子印迹膜和待测分子结合；

3)采用分子印迹膜电喷雾电离质谱法(mim-esi-ms)对分子印迹膜上结合待测分子，盐酸克伦特罗、甲氨蝶呤、环丙沙星和毒死蜱进行检测。

其中，为了保证分子印迹膜的特异性吸附和富集功能，必须采取合适的方法合成相应的分子印迹膜。

步骤1)中制备分子印迹膜的方法，具体为：

模板分子莱克多巴胺(rac)，在功能单体maa、交联剂egdma和引发剂aibn的参与下，加入经表面修饰和活化的微滤膜。最后，得到反应后的分子印迹膜。用10％乙酸甲醇溶液反复洗涤以除去模板分子，洗涤挥干，干燥备用。

模板分子甲氧苄啶(tmp)，在功能单体maa、交联剂egdma和引发剂aibn的参与下，加入经表面修饰和活化的微滤膜。最后，得到反应后的分子印迹膜。用20％乙酸甲醇溶液洗涤除去模板分子，洗涤挥干，干燥备用。

模板分子诺氟沙星(nflx)，在功能单体maa、交联剂egdma和引发剂aibn的参与下，加入经表面修饰和活化的微滤膜。最后，得到反应后的分子印迹膜。用20％乙酸甲醇溶液洗涤除去模板分子，洗涤挥干，干燥备用。

模板分子甲基立枯磷(tcfm)，在功能单体maa、交联剂egdma和引发剂aibn的参与下，加入经表面修饰和活化的微滤膜。最后，得到反应后的分子印迹膜。用20％乙酸甲醇溶液洗涤除去模板分子，洗涤挥干，干燥备用。

步骤2)中所述分子印迹膜与待测分子的结合在模拟样本体系中进行。结合的方式为：将待测物质先在甲醇或乙腈溶液中溶解配成母液，然后根据实验需求添加到模拟样本体系中，最后加入分子印迹膜，在室温下摇晃20min进行结合。

步骤3)中采用分子印迹膜电喷雾质谱法(mim-esi-ms)进行检测，所用装置为分子印迹膜电喷雾离子源-质谱仪，所用洗脱溶剂为0.1％甲酸甲醇溶液，膜上添加洗脱溶剂后，经电喷雾电离装置使样品洗脱溶解形成喷雾并离子化，然后进入质谱仪入口进行检测。

本发明所述的膜电喷雾离子源装置可采用申请号为201410528504.0(发明名称为用于质谱分析的膜电喷雾离子源装置、离子化方法及包含该离子源装置的质谱仪)的发明申请中提及的膜电喷雾离子源装置。离子源装置包含膜和导电部件。

本发明所述用于质谱分析的分子印迹膜电喷雾离子化方法，包括：将分子印迹膜的尖端指向质谱仪进样口；通过一导电部件向所述分子印迹膜施加高压电；向所述分子印迹膜上添加洗脱溶剂；在高电压及所述洗脱溶剂的作用下，所述待测样品形成喷雾并离子化。

向所述分子印迹膜施加1-5kv高压电，优选的是2.5kv。

所述冲洗溶剂为甲醇和甲酸的混合物。其中所述甲醇和甲酸的体积比为100：0.1。

二级质谱采用碰撞诱导解离(cid)对待测分子进行结构解析。母离子采样的质量范围选取2.0m/z，碰撞能量选取25％。

本发明还提供了一种适用于分子印迹膜电喷雾电离质谱法检测的分子印迹膜，通过以下方法制备得到：将表面修饰与活化后的微滤膜加入含有模板分子、功能单体、交联剂、引发剂的反应溶剂中处理，氮气脱氧；所述模板分子的选择原则为与待测分子类似物质；所述反应溶剂为氯仿和/或甲醇所述功能单体为maa，交联剂为egdma，引发剂为aibn；

反应溶剂为氯仿和/或甲醇；

具体操作为用反应溶剂充分溶解模板分子，然后加入功能单体，预聚合1h；接着加入交联剂和引发剂，溶解后加入经表面修饰和活化的微滤膜，脱氧，在室温下反应1-3h，将反应后的微滤膜转移到氮气环境下恒温50-70℃反应24-30h；反应结束后，用10％-20％乙酸甲醇溶液反复洗涤，再用纯水洗涤至中性，用丙酮洗涤并挥干，备用。

本发明采用分子印迹膜电喷雾电离质谱实现对模拟生物样本中添加的盐酸克伦特罗、甲氨蝶呤、环丙沙星和毒死蜱的定性、定量检测。本发明采用分子印迹膜吸附复杂样本中的低浓度待测物质，极大提高了检测灵敏度，实验耗时不到30min。总体上实现了极高灵敏度下对待测物质的快速检测。

本发明将分子印迹聚合物和膜电喷雾电离技术结合，开发了新型质谱离子化技术-分子印迹膜电喷雾电离(mim-esi)。在商品化微滤膜表面键合上分子印迹聚合物，形成分子印迹膜。该膜吸附样本后可以直接用于实时离子化和质谱分析。由于分子印迹膜的特异性识别和富集作用，mim-esi-ms可以实现复杂样本中痕量物质的实时快速质谱分析，与nanoesi或其他敞开式电离技术对比，灵敏度可提高10-50倍。本发明方法还可以根据待测结构和性质合成相应的分子印迹膜，适用于不同领域，有广阔的应用前景。

本发明利用分子印迹膜电喷雾电离质谱实现了在食品安全、血药浓度、抗生素残留和农药残留领域的检测分析，该技术可以完成在复杂样本的实时快速质谱检测，无需样本前处理，质谱分析时间小于1min，整体实验耗时小于30min。并且本发明还可以通过更换针对不同待测物质的分子印迹膜从而实现不同物质的检测，应用前景广泛，除了本发明中的提及的四个领域外，还可以拓展应用于临床，刑侦，能源等领域的实际样本检测，故分子印迹膜电喷雾电离质谱法具有良好的应用前景。

附图说明

图1a-图1f为本发明分子印迹膜的扫描电镜图和红外光谱图，图1a-图1f分别为空白pvdf膜的扫描电镜图；结合模板分子莱克多巴胺的分子印迹膜；洗脱除去模板分子莱克多巴胺后的分子印迹膜；空白pvdf膜的红外光谱图；结合模板分子莱克多巴胺的分子印迹膜的红外光谱图；洗脱除去模板分子莱克多巴胺的分子印迹膜的红外光谱图。

图2为本发明分子印迹膜电喷雾离子源装置操作的结构示意图。1代表分子印迹膜，2代表导电部件，常用为导电铜夹。

图3为利用本发明方法mim-esi-ms分析瘦肉精盐酸克伦特罗(cle)的结果，其中，a图：尿液样本中cle的标准曲线；b图：尿液样本中cle(0.1ng·ml^-1)的一级质谱图；c图：尿液样本中cle(0.1ng·ml^-1)的二级质谱图；d图：空白样本的二级质谱图。

图4为利用本发明方法mim-esi-ms分析血药浓度(甲氨蝶呤，mtx)、农药残留(毒死蜱，cpf)和抗生素残留(环丙沙星，cpfx)，其中，a图和d图分别为血液样本中mtx的标准曲线和二级质谱图；b图和e图分别为土壤样本中cpf的标准曲线和二级质谱图；c图和f图分别是牛奶样本中的cpfx的标准曲线和二级质谱图。

图5为分子印迹膜与非分子印迹膜的特异性吸附对比。

图6a-图6f为模拟生物样本中环丙沙星的三种离子源方法对比分析图，图6a-图6b分别为：利用nanoesi、ps和mim-esi三种离子源分析牛奶中环丙沙星的标准曲线；利用mim-esi分析牛奶中环丙沙星的一级和二级质谱图；图6c和图6d为利用nanoesi分析牛奶中环丙沙星的一级和二级质谱图；图6e和图6f为利用ps分析牛奶中环丙沙星的一级和二级质谱图。

具体实施方式

下面参考附图来说明本发明的实施例。在本发明的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述。下面结合附图对本发明做进一步描述。

分子印迹技术的原理，洗去模板分子后留下对某种特定的模板分子及其类似物具有选择识别性的空穴。为了避免模板分子未完全洗脱的残留影响后续的定量，这里采用了模板分子和待测分子非同一分子的模式。并且，一些模板分子，如甲氨蝶呤，在常用的分子印迹反应溶剂中溶解度差而难以合成，这里采用伪模板分子用于合成分子印迹膜。

本发明中所用材料和试剂。

表1试剂列表

实施例1分子印迹膜表面修饰与活化(以pvdf膜为例)

将pvdf膜浸入3％的naoh水溶液中，在60℃下处理12h，用纯水清洗膜表面，接着将处理过的膜浸入含有10％丙烯酸和1％过硫酸钾的水溶液中，经氮气脱氧后，在70℃下恒温反应5h。然后，将处理好的pvdf膜依次浸在纯水中1h，乙腈中30min，0.15mol·l^-1aibn乙腈溶液中20min进行活化，最后挥干乙腈立即浸入分子印迹反应液中。

实施例2莱克多巴胺分子印迹膜的合成

称取0.0052g模板分子莱克多巴胺(rac)，加入10.43μl功能单体maa，用0.06ml甲醇充分溶解后，加入0.3ml氯仿，密封后在室温下预聚合1h。然后加入0.1178ml交联剂egdma和0.0060g引发剂aibn，待完全溶解后，加入实施例1制得的经表面修饰和活化的pvdf膜，超声10min除去氧气，在室温下反应2h。最后，将反应后的pvdf膜转移到氮气环境下恒温65℃反应24h。反应结束后，用10％乙酸甲醇溶液反复洗涤以除去模板分子，然后用纯水洗涤至中性，用丙酮洗涤并挥干，将分子印迹膜保存在干燥器中备用。

实施例3甲氧苄啶分子印迹膜的合成

称取0.0232g模板分子甲氧苄啶(tmp)，加入34.2μl功能单体maa，用1.5ml氯仿充分溶解后，密封后在室温下预聚合1h。然后加入0.4526ml交联剂egdma和0.0050g引发剂aibn，待完全溶解后，加入实施例1制得的经表面修饰和活化的pvdf膜，超声10min除去氧气，在室温下反应2h。最后，将反应后的pvdf膜转移到氮气环境下恒温55℃反应24h。反应结束后，用20％乙酸甲醇溶液反复洗涤以除去模板分子，然后用纯水洗涤至中性，用丙酮洗涤并挥干，将分子印迹膜保存在干燥器中备用。

实施例4诺氟沙星分子印迹膜的合成

称取0.0319g模板分子诺氟沙星(nflx)，加入34.2μl功能单体maa，用1.0ml氯仿:甲醇(4:1)混合溶液充分溶解后，密封后在室温下预聚合1h。然后加入0.1886ml交联剂egdma和0.0050g引发剂aibn，待完全溶解后，加入实施例1制得的经表面修饰和活化的pvdf膜，超声10min除去氧气，在室温下反应2h。最后，将反应后的pvdf膜转移到氮气环境下恒温60℃反应24h。反应结束后，用20％乙酸甲醇溶液反复洗涤以除去模板分子，然后用纯水洗涤至中性，用丙酮洗涤并挥干，将分子印迹膜保存在干燥器中备用。

实施例5甲基立枯磷分子印迹膜的合成

称取0.04517g模板分子甲基立枯磷(tcfm)，加入51.2μl功能单体maa，用1.5ml乙腈充分溶解，密封后4℃下预聚合10h。然后加入565.8μl交联剂egdma和0.0030g引发剂aibn，待完全溶解后，加入实施例1制得的经表面修饰和活化的pvdf膜，超声10min除去氧气，在室温下反应2h。最后，将反应后的pvdf膜转移到氮气环境下恒温60℃反应24h。反应结束后，用20％乙酸甲醇溶液反复洗涤以除去模板分子，然后用纯水洗涤至中性，用丙酮洗涤并挥干，将分子印迹膜保存在干燥器中备用。

实施例6非分子印迹膜的合成

除不加入模板分子外，其余步骤与上述合成分子印迹步骤相同。

实施例7利用分子印迹膜电喷雾电离质谱法直接快速分析模拟生物样本中的盐酸克伦特罗、甲氨蝶呤、环丙沙星和毒死蜱的方法建立

1、分子印迹膜表面形态和性质表征

通过扫描电镜(日立su8010，日本)和红外光谱(tensorii，德国bruker)对合成的四种分子印迹膜表面形态及性质表征。

以莱克多巴胺为模板分子合成的分子印迹膜为例，对分子印迹膜的扫描电镜图显示，相对于空白pvdf膜(图1a)，分子印迹膜(图1b)表面可以看到很明显的聚合网状结构，说明分子印迹材料键合在pvdf膜表面。同时洗脱除去模板分子后的分子印迹膜(图1c)，可以看到细的pvdf纤维。对分子印迹膜的红外光谱图显示，相对于空白pvdf膜(图1d)，结合了莱克多巴胺的分子印迹膜(图1e)。由于racn-h中的n以离子键形式与h相连，具有较高的电负性，是强的质子给予体，能够与maa中的cooh作用形成稳定的氢键。当两者结果后，红外光谱发生了变化，振动峰向高波数移动，出现蓝移，所以1698cm^-1为n-h的变形振动吸收峰，2945cm^-1为-oh的特征吸收峰，799,753cm^-1为苯环上特征吸收峰，综上，从红外谱图中可以看出，莱克多巴胺与maa之间形成了稳定的氢键，说明以rac为模板分子的分子印迹材料键合在pvdf膜上。图1f为洗脱除去rac后分子印迹膜的红外光谱，可以看出，rac基本除去，可用于后续吸附实验。

2、模拟生物样本中分子印迹膜和待测分子结合

将待测物质在甲醇或乙腈中溶解配成母液。

在使用了瘦肉精的猪的尿液中可以检测到瘦肉精，这里选取人尿液作为模拟生物样本，模拟猪尿的生物环境。甲基蝶呤作为抗癌药物在化疗中广泛使用，存在于病人的血液中，这里选取生物大鼠的血液作为模拟生物样本，模拟病人血液的生物环境。环丙沙星作为抗生素药物广泛用于食品和药品中，这里选取牛奶作为模拟生物样本。毒死蜱作为有机磷农药被用于农业生产中，并残留在土壤或者农作物中，这里选取土壤作为模拟生物样本。在1.5ml模拟生物样本中配成0.1-100000ng·ml^-1浓度梯度(盐酸克伦特罗)，0.5-10000ng·ml^-1浓度梯度(甲氨蝶呤)，1-1000ng·ml^-1浓度梯度(毒死蜱)，1-5000ng·ml^-1浓度梯度(环丙沙星)。分别对应的加入扇形的实施例2-5制得分子印迹膜(扇形半径约5mm，圆心角45°)，在室温下摇晃吸附20min。

3、模拟生物样本的分子印迹膜电喷雾电离质谱法(mim-esi-ms)快速分析

所有mim-esi-ms实验通过brukerhct质谱仪(德国brukerdaltonics有限公司)进行。

所采用分子印迹膜电喷雾电离装置(mim-esi-ms)，如图2所示，包括：分子印迹膜1；导电部件2，分子印迹膜1经过实施例7.2所述与待测分子结合后，与导电部件2相连，导电部件2为良好导电体，常用的为铜夹子。

分子印迹膜1具有至少一尖端，即进样端，将该尖端正对质谱仪进样口，并使导电部件2、尖端、质谱仪进样口位于同一直线上，便于在质谱仪进样口实现样品的电喷雾。

分子印迹膜1的尖端可以为一锐角、直角或钝角，其角度优选为40-150°，对透析膜2的具体形状没有限定，其可以为前部具有一尖端，后部呈圆弧形的不规则形状；也可以是规则的三角形，优选为45°扇形，半径可以为5-10mm，优选为5-7mm。

采用氮气为干燥气体(流速10l·min^-1；温度150℃)。正离子模式，毛细管电压为-2.5kv。如图2所示，分子印迹膜电喷雾电离质谱装置(mim-esi-ms)为用金属夹将吸附了待测物质的分子印迹膜固定于质谱进样口前端，三角形膜的尖端对准质谱入口，并与之保持约5mm的距离。并加上2.5kv的直流电压，8微升的洗脱溶剂加入到膜上(甲醇：甲酸体积比为100：0.1)。在高压电场及洗脱溶剂的作用下，待测溶液向分子印迹膜的前端运动，在前端的一角产生样品离子并形成喷雾。

选取人尿液作为模拟生物样本，模拟猪尿的生物环境。在1.5ml尿液样本中添加盐酸克伦特罗母液，配成0.1-100000ng·ml^-1浓度梯度，将实施例2合成的分子印迹膜完全浸入溶液中，室温下摇晃20min。随后利用mim-esi-ms分析，结果如图3所示。图3的a图分析尿液中盐酸克伦特罗标准曲线，线性范围为0.1-100000ng·ml^-1，相关系数(r²)为0.9973，lod和loq分别为0.02ng·ml^-1和0.1ng·ml^-1。图3的b-c图示尿液中盐酸克伦特罗浓度为0.1ng·ml^-1的一级和二级质谱图，成功检测到盐酸克伦特罗的母子离子对(m/z277→259,203)。图3的d图示在阴性样本中未检出盐酸克伦特罗。

除了食品安全领域的应用外，mim-esi-ms还应用在其他领域中，例如血药浓度、抗生素残留和农药残留。如图4所示，利用mim-esi-ms分析血液中mtx、土壤中cpf和牛奶中cpfx的结果。图4a-c所示，分析血液中mtx、土壤中cpf和牛奶中cpfx所得的标准曲线，通过分子印迹膜对待测分子的富集作用，以上mtx、cpf和cpfx检出限分别为0.5ng·ml^-1，1.0ng·ml^-1和1.0ng·ml^-1。图4d-4f示mtx、cpf和cpfx的二级质谱图，成功检测到血液样本中的mtx(母子离子对m/z455→308)，土壤样本中的cpf(母子离子对m/z350→335)和牛奶样本中的cpfx(母子离子对m/z332→313，287)。

2、分子印迹膜特异性识别吸附验证

考察合成的分子印迹膜对待测分子的特异性吸附效果。以分析模拟生物样本中的环丙沙星为例，在牛奶模拟样本中添加环丙沙星母液，三个浓度水平(高浓度：1μg·ml^-1；中浓度：10ng·ml^-1；低浓度：1ng·ml^-1)。将实施例4和实施例6合成的分子印迹膜分别浸入添加环丙沙星的牛奶样本中，室温摇晃吸附20min后，利用mim-esi-ms分析。如图5所示，分子印迹膜的吸附效果高于非分子印迹膜，且环丙沙星浓度越低两者差异越大，说明分子印迹膜的特异性识别效果明显。

3、mim-esi-ms与nanoesi质谱法和纸喷雾质谱法(ps)对比分析

将待测物质在甲醇或乙腈中溶解配成母液，然后在1.5ml模拟生物体系中配成1-5000ng·ml^-1浓度梯度(环丙沙星)。分别采用nanoesi质谱法和纸喷雾质谱法分析，并对三种方法的结果进行对比分析。

nanoesi质谱法，采用氮气为干燥气体(流速10l·min^-1；温度150℃)。正离子模式，毛细管电压为-1.2kv。毛细管的尖端对准质谱入口，并与之保持约5mm的距离。

ps质谱法，用金属夹将三角形色谱纸固定于质谱进样口前端，三角形纸的尖端对准质谱入口，并与之保持约5mm的距离。并加上4.5kv的直流电压，8微升的洗脱溶剂加入到膜上(甲醇：甲酸体积比为100：0.1)。在高压电场及洗脱溶剂的作用下，待测溶液向分子印迹膜的前端运动，在前端的一角产生样品离子并形成喷雾。

mim-esi-ms的原理与mesi和ps相似。通过分子印迹膜对待测分子的特异性吸附和富集作用，mim-esi的定量检出限较其他敞开式电离技术更低。以分析模拟生物样本中的环丙沙星为例，对比三种分析方法：mim-esi、ps和nanoesi。mim-esi较其他两种方法的线性范围更宽(图6a)。图6b-图6f为利用三种方法分析环丙沙星的一级和二级质谱图结果，环丙沙星的母子离子对(m/z332→313，287)，对比三种方法可以发现，mim-esi的loq更低，为1.0ng·ml^-1，而nanoesi和ps分别为50ng·ml^-1和10ng·ml^-1。说明分子印迹膜的有效地吸附并富集了待测分子，mim-esi-ms适合复杂环境中痕量目标物的分析。

实施例8方法学验证

本发明考察分子印迹膜吸附模拟生物样本中的待测物质溶液后得到的质谱信号强度，从而得到标准曲线的线性，lod和loq。如表2所示，4个待测分子在0.1-100000ng·ml^-1(cle)，0.5-10000ng·ml^-1(mtx)，1-1000ng·ml^-1(cpf)，1-5000ng·ml^-1(cpfx)的线性范围的相关系数(r²)为0.9973,0.9982,0.9931,0.9948。尿液模拟样本中的盐酸克伦特罗的lod为0.02ng·ml^-1，loq为0.1ng·ml^-1；血液模拟样本中的甲氨蝶呤的lod为0.1ng·ml^-1，loq为0.5ng·ml^-1；土壤模拟样本中的毒死蜱的lod为0.5ng·ml^-1，loq为1.0ng·ml^-1；牛奶模拟样本中的环丙沙星的lod为0.5ng·ml^-1，loq为1.0ng·ml^-1。本发明对利用mim-esi-ms分析四种待测物质的方法学验证，包括线性范围、lod、loq、准确度、精密度和回收率，结果如表3所示。本方法的mim-esi-ms在日间准确度和日内准确度、日间精密度和日内精密度有很好的平行性，并且该方法可以得到很好的回收率，对于分析复杂样本中的痕量物质具有较好的定量分析能力。

表2四个待测分子的线性范围、最低检出限和最低定量限

表3四个待测分子的准确度、精密度、回收率

虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。