一种基于双振镜双物镜多模式宽场超分辨显微成像系统的制作方法

本发明属于光学超分辨显微成像领域，特别涉及一种基于双振镜双物镜多模式宽场超分辨显微成像系统。

背景技术：

超分辨荧光显微成像技术的出现为现代生物医学研究提供了新的强有力的工具，将荧光显微镜的应用推到了新的高度。与其它研究方法，如核磁共振、电子显微镜、ct等相比，光学超分辨显微镜具有独一无二的优势，如成像无需进行特殊组织制备；使用荧光探针标记可以特异性地研究某物质的结构和功能；可以很方便的通过多色多通道同时观测多个蛋白分子；可以进行活体成像，获取较大区域内的样品信息；可以对生物组织进行三维成像等。因此，光学超分辨荧光显微成像技术在过去的几十年里已经发展的较为成熟。2014年诺贝尔化学奖授予了ericbetzig、stefanhell以及williammoerner三位科学家，以表彰他们在“超分辨荧光显微镜”领域的贡献。

由于光学衍射极限的存在，一个理想点物经过成像系统之后会变成一个有限大小的弥散斑，其横向强度分布可以用贝塞尔函数来描述，轴向强度分布用辛格函数来描述，且轴向分辨率比横向分辨率要差三倍左右。有多种超荧光显微成像技术可以突破横向或轴向衍射极限，实现超分辨。如：结构光照明显微成像技术使用两束光在待测样品表面相互干渉产生条纹图样，调制样品的空间频率，将高频信息移动到可观测到的低频范围内，从而将横向分辨率提高了两倍；驻波干涉显微成像技术在样品两侧使用两个对称放置的物镜，两束垂直入射光在样品轴向方向发生干涉，从而使得轴向的高频信息可被观测到，在轴向实现了超分辨；全内反射显微成像技术使用大数值孔径物镜使得入射光在样品表面发生全反射，在很小的轴向范围内通过倏逝波激发荧光，在轴向实现了层析和超分辨。

技术实现要素：

本发明提供了一种基于双振镜双物镜多模式宽场超分辨显微成像系统，利用双振镜加双物镜结构，该装置可以同时实现驻波干涉、结构光照明和多角度环状全内反射宽场超分辨显微成像，可以满足使用者在不同条件下的需求，特别适用于对荧光样品进行成像。

一种基于双振镜双物镜多模式宽场超分辨显微成像系统，包括：激发光路模块和成像光路模块。其中激发光路模块包括激光器、分束镜、两套4f扫描振镜系统、两个显微物镜和待测荧光样品；成像光路模块包括两个显微物镜、两个二向色镜和两个工业相机。

所述激发光路模块用于将入射激光分为两路，从样品上下表面入射。

所述激光器与分束镜之间依次放置有单模光纤和起偏器。所述激光器用于产生入射光。所述单模光纤用于对激光器产生的光束进行滤波。所述起偏器用于将激光器产生的光束变为线偏振光。

所述激发光路分束镜用于将入射光分为两路，依次各自经过扫描振镜系统，进入显微物镜后瞳面，激发待测样品发出荧光。其中一路光直接进入扫描振镜系统中，另一路光经平面反射镜反射后再进入扫描振镜系统，平面镜用于改变光路传播方向，同时通过压电陶瓷驱动在结构光照明成像模式中对结构光图样进行相移。两路光的光程需要满足干涉条件，以便能够进行驻波干涉和结构光照明成像两种模式。

所述两套扫描振镜系统都采用透射式4f透镜结构，用于控制显微物镜后瞳面处的光束入射角在0°、小于全反射临界角和大于全反射临界角范围内切换，从而实现驻波干涉、结构光照明和多角度环状全内反射等多种宽场超分辨显微成像模式的切换，同时在结构光照明和全内反射显微成像模式中分别通过振镜控制光束扫描实现结构光照明图样方向的旋转和多角度环状全内反射。所述两套透射式4f扫描振镜系统也可采用反射式，其焦面位置处各放置有一个切向光偏振转换器，用于将入射线偏振光转换到切向偏振方向，始终保持结构光图样的对比度最高。

所述两套扫描振镜系统和待测荧光样品之间依次各自放置有扫描透镜和显微物镜。所述两个扫描透镜焦面与对应显微物镜入瞳面重合，对像面进行转移。所述两个显微物镜均为全内反射式物镜，na＝1.49，用于将两束切向线偏振光聚焦到待测样品表面激发荧光。

所述成像光路模块用于收集待测样品发出的两路荧光信号，利用计算机进行数据处理和图像重构。

所述两个显微物镜分别放置在待测样品上下表面附近，用于收集待测样品发出的荧光信息。所述两个二向色镜用于透射入射光、反射荧光。

所述两个二向色镜和两个工业相机之间依次各放置一个滤波片和汇聚透镜。所述两个滤波片用于滤去待测样品发出的荧光信号中的杂散光。所述两个汇聚透镜焦平面与对应显微物镜入瞳面重合，用于将待测样品发出的荧光信号成像到对应的工业相机上。

所述两个工业相机得到的样品信息需要利用计算机通过相应算法进行数据处理和重构，以得到相应成像模式下的超分辨图像。

本发明原理如下：

驻波干涉显微成像技术和结构光照明显微成像技术的原理十分相似，都是使用两束光进行干涉，得到的正弦干涉条纹由于存在两个高频分量，会对样品进行调制，将通常无法被成像系统接受的高频信息转移到低频范围内，从而获得了更多的样品信息，提高了系统分辨率。两者的主要区别是驻波干涉显微成像技术中两束光垂直相向入射，在样品轴向方向发生干涉，所以调制的高频信息中大部分都是轴向高频信息；而结构光照明显微成像技术中两束光以一定角度斜入射，在样品横向方向发生干涉，主要提高了横向分辨率。鉴于两种超分辨显微成像原理相似，所以有可能将其集成到一套系统中，方便用户在不同条件下的使用。

另一方面，全内反射显微成像技术是以大于全反射临界角入射，在样品表面发生全反射产生倏逝波激发待测样品发出荧光信号，考虑到全内反射成像最主要的需求是大数值孔径物镜，因此有可能通过驻波干涉显微成像系统实现。

本发明以驻波干涉显微成像系统为基础，使用两个大数值孔径物镜以尽可能多的获取样品发出的荧光信号，大数值孔径物镜也确保了全内反射可以实现。同时在两路入射光路各加入一套扫描振镜系统，通过计算机控制振镜扫描改变入射光到达两个显微物镜后瞳面的角度和位置，进而控制样品上的光束入射角，使其在垂直入射、小于全反射临界角入射和大于全反射临界角入射范围内切换，从而选择不同的成像模式。

驻波干涉显微成像模式下，控制振镜使得两束激发光从相反方向垂直入射样品，在样品轴向方向发生干涉，产生的荧光信号也分为两路收集，各自成像在一个工业相机上。对得到的图像进行处理获取驻波干涉超分辨结果。

结构光照明显微成像模式下，控制振镜使得两束激发光从待测样品两侧以小于全反射临界角入射，在样品同一横向位置处发生干涉。再通过压电陶瓷控制反射镜发生位移调节光程差，得到相移结构光照明图样。然后通过计算机控制振镜系统进行扫描，得到不同方向的结构光照明图样。对得到的多幅样品图像进行数据处理可以重构得到超高分辨率的荧光图像。

多角度环状全内反射显微成像模式下，控制振镜使得两束激发光从待测样品两侧以大于全反射临界角入射，分别在样品两侧以倏逝波激发荧光信号，各自进入相应的工业相机，实现不同表面位置的轴向超分辨。若样品足够薄，双侧同时全内反射成像即相当于获取了样品的三维信息。同时控制振镜系统使得入射光在样品表面以全内反射模式进行环状扫描，即可得到多方位角度全内反射图像，相比单角度全内反射光场更均一，图像质量更好。

与现有技术相比，本发明无需替换任何元件，在一套系统中集成了驻波干涉、结构光照明和多角度环状全内反射等多种宽场超分辨显微成像模式，可以满足用户大部分条件下的使用需求，大大节省了成本，对光学超分辨显微成像技术的发展和实用化具有重要意义和重大价值。

附图说明

图1为基于双振镜双物镜多模式宽场超分辨显微成像系统示意图。

图2(a)为驻波干涉宽场超分辨显微成像模式下图1虚线框部分入射光角度示意图；图2(b)为驻波干涉在样品轴向产生的条纹示意图。

图3(a)为结构光照明宽场超分辨显微成像模式下图1虚线框部分入射光角度示意图；图3(b)为结构光照明在样品横向产生的某方向条纹示意图。

图4为多角度环状全内反射宽场超分辨显微成像模式下图1虚线框部分入射光角度示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示的基于双振镜双物镜多模式宽场超分辨显微成像系统，包括：激光器1、单模光纤2、起偏器3、分束镜4、平面反射镜5、压电陶瓷6、第一振镜7、第一凸透镜8、第一切向光偏振转换器9、第二凸透镜10、第二振镜11、第一扫描透镜12、第一显微物镜13、第三振镜14、第三凸透镜15、第二切向光偏振转换器16、第四凸透镜17、第四振镜18、第二扫描透镜19、第二显微物镜20、待测样品21、第一二向色镜22、第一滤波片23、第一汇聚透镜24、第一工业相机25、第二二向色镜26、第二滤波片27、第二汇聚透镜28、第二工业相机29和计算机30。

激光器1发出激光光束，单模光纤2、起偏器3、分束镜4和平面反射镜5依次放置在入射光路的光轴上。单模光纤2用于对激光光束进行滤波。起偏器3用于将出射光转换成线偏振光。分束镜4用于将入射光分成两路。平面反射镜5用于改变入射光传播方向，同时连接有压电陶瓷6，在结构光照明显微成像模式下，压电陶瓷6用于驱动平面反射镜5进行位移改变两路光的光程差从而使得结构光图样发生相移。

两路入射光分别进入由第一振镜7、第一凸透镜8、第二凸透镜10和第二振镜11构成的第一套扫描振镜系统以及由第三振镜14、第三凸透镜15、第四凸透镜17和第四振镜18构成的第二套扫描振镜系统。通过计算机30控制第一振镜7和第三振镜14进行x方向扫描，第二振镜11和第四振镜18进行y方向扫描，实现两路入射光的圆扫描，同时可以改变入射光角度以切换到不同成像模式。两套扫描振镜系统中的两个振镜由两个凸透镜构成的4f系统连接，采用4f系统可以减小扫描误差，提高成像质量。两个4f系统的焦平面处分别放置有第一切向光偏振转换器9和第二切向光偏振转换器16，用于将入射光转换成两束切向偏振的线偏振光，保证结构光照明成像模式下结构光照明图样条纹对比度最高。

从两套振镜扫描系统出来的两束切向线偏振光各自依次经过共轴放置的第一扫描透镜12、和第一显微物镜13以及第二扫描透镜19和第二显微物镜20，入射到待测荧光样品21上。第一扫描透镜12和第二扫描透镜19的焦平面分别与第二凸透镜10和第四凸透镜17的焦平面重合，另一侧焦平面与第一显微物镜13和第二显微物镜20的入瞳面重合，用于转移物像关系，提高振镜扫描边缘光束入射到物镜入瞳面的能力。第一显微物镜13和第二显微物镜20均为全内反射式物镜，na＝1.49，用于将两束切向线偏振光聚焦到待测样品21表面激发荧光，从两物镜出来的激发光束入射到待测样品21上的角度决定了此时为何种显微成像模式，如图2、3和4所示。

两路入射光激发待测样品21产生的两路荧光信号又分别依次通过第一显微物镜13、第一二向色镜22和第二显微物镜20、第二二向色镜26进入两路探测光路。第一显微物镜13和第二显微物镜20位于待测样品21上下表面附近，用于收集样品发出的荧光信号。第一二向色镜22和第二二向色镜26用于透射入射光、反射荧光。

进入两路探测光路的荧光信号依次各自经过共轴放置的第一滤波片23、第一汇聚透镜24和第二滤波片27、第二汇聚透镜28，进入对应的第一工业相机25和第二工业相机29。第一滤波片23和第二滤波片27用于滤去待测样品21发出的荧光信号中的杂散光。第一汇聚透镜24和第二汇聚透镜28用于将两路荧光信号分别聚焦到第一工业相机25和第二工业相机29上。

计算机30用于控制两套振镜系统进行扫描，改变入射到样品上的入射光线角度，从而实现驻波干涉、结构光照明和多角度环状全内反射等多种宽场超分辨显微成像模式的切换。同时对各种成像模式得到的原始数据和图像通过相应的算法进行重构处理，获取相应模式下的宽场超分辨荧光图像。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。