本发明涉及母乳低聚糖的检测领域，尤其涉及一种母乳低聚糖快速定性定量的方法。
背景技术：
母乳低聚糖具有多种生理功能，不仅可以减少感染的发生，还可有效促进肠道有益菌群的增殖，间接抑制有害菌群生长，以维持肠道微生态平衡，从而保护婴儿肠道免受致病菌侵袭，而且还具有促进婴儿肠道局部和全身免疫系统成熟的作用，小部分母乳低聚糖还可减轻免疫应激反应和预防慢性炎症。另外，也有研究指出低聚糖与神经突触和神经传导关系密切，能促进婴儿的认知发育、增强学习和记忆能力；但母乳低聚糖在母乳中所占的比例只有千分之五到千分之十二，且母乳低聚糖的构成超过200多种，结构复杂，不利于母乳低聚糖的研究，对于母乳低聚糖的检测也设置了很大的难度，现今国内对于母乳低聚糖的研究相对滞后，检测母乳低聚糖的方法不仅耗时较长，而且不能对母乳低聚糖进行定量，提供一种快速检测母乳低聚糖，并可对低聚糖定量的方法是很有必要的。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种母乳低聚糖快速定性定量的方法，其可快速检测12种母乳低聚糖，并可对12种母乳低聚糖定量。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供一种母乳低聚糖快速定性定量的方法，主要包括以下步骤：
步骤1、样品前处理：取150-250μl母乳，去除脂肪和蛋白质，取最终上清液，加超纯水稀释，得上样样品。
步骤2、对标准品采用超高效液相色谱、质谱，建立标准曲线。
步骤3、采用超高效液相色谱将所述上样样品内母乳低聚糖进行不同组分的分离，并利用质谱结合所述标准曲线，进行定量分析，即得所述母乳低聚糖含量。所述超高效液相色谱采用2.1×100mm、1.7μm氨基色谱柱，以8-10mmol/l的甲酸铵溶液(a)和乙腈(b)为流动相；梯度洗脱程序为：0-10min，95％-75％b；10-15min，75％b；15-20min，75％-65％b；20-21min，65％-10％b；21-24min，10％b；24-25min，10-95％b；25-35min，95％b；流速为0.3ml/min，柱温40-60℃。
优选的是，步骤1所述脂肪的去除采用离心的方式，以5000-7000r/min的速度在2-5℃下，将所述母乳离心8-12min后，去除上层脂肪；所述蛋白质的去除是在去除脂肪后的溶液中，加入400-700μl乙腈，涡旋混匀后超声8-12min，以8000-12000r/min的速度在2-8℃下离心8-12min，取上清液。
优选的是，为进一步纯化所述上清液，将所述上清液再次离心，以8000-11000r/min的速度在2-6℃下离心6-10min，取最终上清液。
优选的是，步骤3所述质谱采用电喷雾离子源；正离子扫描；所述质谱参数为：干燥气体温度：100-200℃，干燥气体流速：14-18l/min；雾化器压力：30-40psi；毛细管电压：2-5kv；保温气体温度：250-350℃；保温气体流速：10-15l/min。
优选的是，所述测定的母乳低聚糖为12种低聚糖，所述低聚糖分别为：2-岩藻糖乳糖、3岩藻糖乳糖、3-唾液酸乳糖、6唾液酸乳糖、乳酰-n-岩藻五糖ⅰ、乳酰-n-岩藻五糖ⅲ、乳酰-n-二岩藻六糖ⅱ、乳酰-n-己糖、二唾液乳-n-四糖、乳糖基四糖a、乳糖基四糖b、乳糖基四糖c。
优选的是，步骤3所述标准品为所述12种低聚糖标准品，所述标准品均取1-3mg，将其溶于1-3ml的超纯水中，混匀后得初级标准品溶液，置于-50--80℃储藏。
优选的是，取所述初级标准品溶液建立不同浓度的标准品溶液。
优选的是，所述不同浓度的标准品溶液的建立过程为：取所述2-岩藻糖乳糖、3岩藻糖乳糖的初级标准品溶液各8-12μl，并各加入60-100μl超纯水，得两个混合标样，浓度均为100mg/l，取所述两个混合标样分别逐级稀释成不同的浓度；取所述3-唾液酸乳糖、6唾液酸乳糖、乳酰-n-岩藻五糖ⅰ、乳酰-n-岩藻五糖ⅲ、乳酰-n-二岩藻六糖ⅱ、乳酰-n-己糖、二唾液乳-n-四糖、乳糖基四糖a、乳糖基四糖b、乳糖基四糖c各2-8μl，并各加入30-80μl的超纯水混匀，得十个混合标样，浓度均为50mg/l，取所述十个混合标样分别逐级稀释成不同的浓度。
优选的是，根据所述不同浓度的混合标样，建立所述标准曲线。
本发明至少包括以下有益效果：
通过将样品前处理，并两次离心的方式，使母乳低聚糖溶液的纯度更高，一定程度保证了检测结果的准确度，并通过超高效液相色谱、质谱的方式，在标准品的基础上建立标准曲线，以同样的方式检测所述上样样品内的母乳低聚糖，并结合所述标准曲线得所述母乳低聚糖的含量，所述超高效液相色谱采用2.1×100mm、1.7μm氨基色谱柱，更有利于母乳低聚糖分离，所述超高效液相色谱速度、灵敏度及分离度更高，大大缩短了分析时间，使得母乳低聚糖的检测更为快速，更加精准，再利用所述标准曲线，结合检测结果，可实现对所述12种母乳低聚糖定量，更利于母乳低聚糖领域研究的深入，本发明所述母乳低聚糖快速定性定量的方法可准确有效的检测12种母乳低聚糖，并可准确的得到所述12种母乳低聚糖的含量。
本发明的其它优点、目，标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述的母乳低聚糖快速定性定量的方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
如图1所示，本发明提供一种母乳低聚糖快速定性定量的方法，主要包括以下步骤：
步骤1、样品前处理：取150-250μl母乳，去除脂肪和蛋白质，取最终上清液，加超纯水稀释，得上样样品。
步骤2、对标准品采用超高效液相色谱、质谱，建立标准曲线。
步骤3、采用超高效液相色谱将所述上样样品内母乳低聚糖进行不同组分的分离，并利用质谱结合所述标准曲线，进行定量分析，即得所述母乳低聚糖含量。所述超高效液相色谱采用2.1×100mm、1.7μm氨基色谱柱，以8-10mmol/l的甲酸铵溶液(a)和乙腈(b)为流动相；梯度洗脱程序为：0-10min，95％-75％b；10-15min，75％b；15-20min，75％-65％b；20-21min，65％-10％b；21-24min，10％b；24-25min，10-95％b；25-35min，95％b；流速为0.3ml/min，柱温40-60℃。
在上述方案中，步骤1通过将样品前处理，并两次离心的方式，使母乳低聚糖溶液的纯度更高，一定程度保证了检测结果的准确度，并通过超高效液相色谱、质谱的方式，在标准品的基础上建立标准曲线，以同样的方式检测所述上样样品内的母乳低聚糖，并结合所述标准曲线得所述母乳低聚糖的含量，所述超高效液相色谱采用2.1×100mm、1.7μm氨基色谱柱，更有利于母乳低聚糖分离，所述超高效液相色谱速度、灵敏度及分离度更高，大大缩短了分析时间。
一个优选方案中，步骤1所述脂肪的去除采用离心的方式，以5000-7000r/min的速度在2-5℃下，将所述母乳离心8-12min后，去除上层脂肪；所述蛋白质的去除是在去除脂肪后的溶液中，加入400-700μl乙腈，涡旋混匀后超声8-12min，以8000-12000r/min的速度在2-8℃下离心8-12min，取上清液。
在上述方案中，因所述母乳低聚糖具有亲水性，采用离心的方式，可分离水油层，去除脂肪，再在去除脂肪的溶液中加入纯乙腈，使蛋白质沉淀，再利用离心的方式进一步将沉淀蛋白质分离出来，以得到纯化的母乳低聚糖溶液。
一个优选方案中，为进一步纯化所述上清液，将所述上清液再次离心，以8000-11000r/min的速度在2-6℃下离心6-10min，取最终上清液。
在上述方案中，将所述上清液再次离心，进一步纯化母乳低聚糖溶液，并提高了纯化效率。
一个优选方案中，步骤3所述质谱采用电喷雾离子源；正离子扫描；所述质谱参数为：干燥气体温度：100-200℃，干燥气体流速：14-18l/min；雾化器压力：30-40psi；毛细管电压：2-5kv；保温气体温度：250-350℃；保温气体流速：10-15l/min。
在上述方案中，所述质谱方式的选择，更利于检测结果的准确性，先对所述标准品质谱建立所述标准曲线，再对所述上样样品质谱，便于后续所述母乳低聚糖的定量，标准品质谱多反应监测优化结果如表1所示。
一个优选方案中，所述测定的母乳低聚糖为12种低聚糖，所述低聚糖分别为：2-岩藻糖乳糖、3岩藻糖乳糖、3-唾液酸乳糖、6唾液酸乳糖、乳酰-n-岩藻五糖ⅰ、乳酰-n-岩藻五糖ⅲ、乳酰-n-二岩藻六糖ⅱ、乳酰-n-己糖、二唾液乳-n-四糖、乳糖基四糖a、乳糖基四糖b、乳糖基四糖c。
一个优选方案中，步骤3所述标准品为所述12种低聚糖标准品，所述标准品均取
1-3mg，将其溶于1-3ml的超纯水中，混匀后得初级标准品溶液，置于-50--80℃储藏。
一个优选方案中，取所述初级标准品溶液建立不同浓度的标准品溶液。
一个优选方案中，所述不同浓度的标准品溶液的建立过程为：取所述2-岩藻糖乳糖、3岩藻糖乳糖的初级标准品溶液各8-12μl，并各加入60-100μl超纯水，得两个混合标样，浓度均为100mg/l，取所述两个混合标样分别逐级稀释成不同的浓度；取所述3-唾液酸乳糖、6唾液酸乳糖、乳酰-n-岩藻五糖ⅰ、乳酰-n-岩藻五糖ⅲ、乳酰-n-二岩藻六糖ⅱ、乳酰-n-己糖、二唾液乳-n-四糖、乳糖基四糖a、乳糖基四糖b、乳糖基四糖c各2-8μl，并各加入30-80μl的超纯水混匀，得十个混合标样，浓度均为50mg/l，取所述十个混合标样分别逐级稀释成不同的浓度。
一个优选方案中，根据所述不同浓度的混合标样，建立所述标准曲线。
在上述方案中，所述快速测定母乳低聚糖的方法针对的是所述12种母乳低聚糖，所述12种母乳低聚糖在母乳样品中含量差别较大，因此分为两部分做混合标样，所建不同浓度的标准品溶液，如表2所示，根据表2中不同浓度的标准品溶液建立标准曲线并得所述标准曲线的方程，如表3所示；将所述质谱结果与所述标准曲线结合，即可对所述12种母乳低聚糖定量。
所述母乳低聚糖快速定性定量的方法如图1所示。
实施例1
步骤1、取150μl母乳加入等体积的超纯水，5000r/min，2℃离心8min后，去除上层脂肪，然后加入400μl的纯乙腈，涡旋混匀后超声8min，8000r/min，2℃离心12min后取上清，再将上清液离心，以8000r/min的速度在2℃下，将所述上清液离心12min后，取最终上清液，加入超纯水稀释后即可用来上样。
步骤2、将所购12种标准品均取0.5mg，将其溶于0.5ml的超纯水中，混匀后得初级标准品溶液，放置-50℃下储藏。
步骤3、取2-岩藻糖乳糖、3岩藻糖乳糖的初级标准品溶液各8μl，并各加入60μl超纯水，得两个混合标样，浓度均为100mg/l，取所述两个混合标样分别逐级稀释成不同的浓度；取所述3-唾液酸乳糖、6唾液酸乳糖、乳酰-n-岩藻五糖ⅰ、乳酰-n-岩藻五糖ⅲ、乳酰-n-二岩藻六糖ⅱ、乳酰-n-己糖、二唾液乳-n-四糖、乳糖基四糖a、乳糖基四糖b、乳糖基四糖c各2μl，并各加入30μl的超纯水混匀，得十个混合标样，浓度均为50mg/l，取所述十个混合标样分别逐级稀释成不同的浓度。
步骤4、对不同浓度的标准品溶液，采用超高效液相色谱、质谱的方式，建立标准曲线。
所述超高效液相色谱采用2.1×100mm、1.7μm氨基色谱柱，以8mmol/l的甲酸铵溶液(a)和乙腈(b)为流动相；梯度洗脱程序为：0-10min，95％-75％b；10-15min，75％b；15-20min，75％-65％b；20-21min，65％-10％b；21-24min，10％b；24-25min，10-95％b；25-35min，95％b；流速为0.3ml/min，柱温40℃。
所述质谱采用电喷雾离子源；正离子扫描；所述质谱参数为：干燥气体温度：100℃，干燥气体流速：14l/min；雾化器压力：30psi；毛细管电压：2kv；保温气体温度：250℃；保温气体流速：10l/min。
步骤5、再以同样的检测方法对上样样品超高效液相色谱、质谱，结合标准曲线，即得所述12种母乳低聚糖含量。
实施例2
步骤1、取200μl母乳加入等体积的超纯水，6000r/min，4℃离心10min后，去除上层脂肪，然后加入600μl的纯乙腈，涡旋混匀后超声10min，10000r/min，4℃离心10min后取上清，再将上清液离心，以10000r/min的速度在4℃下，将所述上清液离心10min后，取最终上清液，加入超纯水稀释后即可用来上样。
步骤2、将所购12种标准品均取1mg，将其溶于1ml的超纯水中，混匀后得初级标准品溶液，放置-80℃下储藏。
步骤3、取2-岩藻糖乳糖、3岩藻糖乳糖的初级标准品溶液各10μl，并各加入80μl超纯水，得两个混合标样，浓度均为100mg/l，取所述两个混合标样分别逐级稀释成不同的浓度；取所述3-唾液酸乳糖、6唾液酸乳糖、乳酰-n-岩藻五糖ⅰ、乳酰-n-岩藻五糖ⅲ、乳酰-n-二岩藻六糖ⅱ、乳酰-n-己糖、二唾液乳-n-四糖、乳糖基四糖a、乳糖基四糖b、乳糖基四糖c各5μl，并各加入50μl的超纯水混匀，得十个混合标样，浓度均为50mg/l，取所述十个混合标样分别逐级稀释成不同的浓度。
步骤4、对不同浓度的标准品溶液，采用超高效液相色谱、质谱的方式，建立标准曲线。
所述超高效液相色谱采用2.1×100mm、1.7μm氨基色谱柱，以9mmol/l的甲酸铵溶液(a)和乙腈(b)为流动相；梯度洗脱程序为：0-10min，95％-75％b；10-15min，75％b；15-20min，75％-65％b；20-21min，65％-10％b；21-24min，10％b；24-25min，10-95％b；25-35min，95％b；流速为0.3ml/min，柱温50℃。
所述质谱采用电喷雾离子源；正离子扫描；所述质谱参数为：干燥气体温度：150℃，干燥气体流速：16l/min；雾化器压力：35psi；毛细管电压：3kv；保温气体温度：300℃；保温气体流速：12l/min。
步骤5、再以同样的检测方法对上样样品超高效液相色谱、质谱，结合标准曲线，即得所述12种母乳低聚糖含量。
实施例3
步骤1、取250μl母乳加入等体积的超纯水，7000r/min，2℃离心8min后，去除上层脂肪，然后加入700μl的纯乙腈，涡旋混匀后超声12min，12000r/min，8℃离心8min后取上清，再将上清液离心，以12000r/min的速度在8℃下，将所述上清液离心8min后，取最终上清液，加入超纯水稀释后即可用来上样。
步骤2、将所购12种标准品均取3mg，将其溶于3ml的超纯水中，混匀后得初级标准品溶液，放置-80℃下储藏。
步骤3、取2-岩藻糖乳糖、3岩藻糖乳糖的初级标准品溶液各12μl，并各加入100μl超纯水，得两个混合标样，浓度均为100mg/l，取所述两个混合标样分别逐级稀释成不同的浓度；取所述3-唾液酸乳糖、6唾液酸乳糖、乳酰-n-岩藻五糖ⅰ、乳酰-n-岩藻五糖ⅲ、乳酰-n-二岩藻六糖ⅱ、乳酰-n-己糖、二唾液乳-n-四糖、乳糖基四糖a、乳糖基四糖b、乳糖基四糖c各8μl，并各加入80μl的超纯水混匀，得十个混合标样，浓度均为50mg/l，取所述十个混合标样分别逐级稀释成不同的浓度。
步骤4、对不同浓度的标准品溶液，采用超高效液相色谱、质谱的方式，建立标准曲线。
所述超高效液相色谱采用2.1×100mm、1.7μm氨基色谱柱，以10mmol/l的甲酸铵溶液(a)和乙腈(b)为流动相；梯度洗脱程序为：0-10min，95％-75％b；10-15min，75％b；15-20min，75％-65％b；20-21min，65％-10％b；21-24min，10％b；24-25min，10-95％b；25-35min，95％b；流速为0.3ml/min，柱温60℃。
所述质谱采用电喷雾离子源；正离子扫描；所述质谱参数为：干燥气体温度：200℃，干燥气体流速：18l/min；雾化器压力：40psi；毛细管电压：5kv；保温气体温度：350℃；保温气体流速：15l/min。
步骤5、再以同样的检测方法对上样样品超高效液相色谱、质谱，结合标准曲线，即得所述12种母乳低聚糖含量。
表112种母乳低聚糖标准品mrm优化结果
表1中2fl、3fl、3sl、6sl、lnfpⅰ、lnfpⅲ、lndfhⅱ、lnnh、dslnt、lsta、lstb、lstc分别对应2-岩藻糖乳糖、3岩藻糖乳糖、3-唾液酸乳糖、6唾液酸乳糖、乳酰-n-岩藻五糖ⅰ、乳酰-n-岩藻五糖ⅲ、乳酰-n-二岩藻六糖ⅱ、乳酰-n-己糖、二唾液乳-n-四糖、乳糖基四糖a、乳糖基四糖b、乳糖基四糖c。
表212种标准品溶液的浓度(mg/l)
表312种母乳低聚糖标品回归方程
由表3可见，12种低聚糖标准品在设定浓度范围内呈良好的线性关系(r2≥0.99)。uplc(超高效液色谱)分析检测方法精密度良好，12种糖类成分重复进样分析的rsd(相对标准偏差)值控制在10％以内。
为验证所述测定方法的可行性和准确度，做加标回收试验来进行评估，取母乳200μl按照前处理方法处理，并按照优化好的质谱液相条件对其中的12种低聚糖成分进行定量分析，获得不加标样品分析结果，并将上述操作重复3次，排出误差，根据测得的各低聚糖成分实际含量水平加标，进行样品检测，检测结果如表4所示。
表412种母乳低聚糖回收率检测结果
由表4可知，12种母乳低聚糖的添加回收率均在80％～120％之间，样品前处理方法的准确性用rsd值表示，且实验所得12种低聚糖的rsd值均小于10％。因此，本实验所建立的方法可以用于母乳中12种低聚糖的检测分析，并选用5名志愿者提供的母乳，用所述快速测定母乳低聚的方法测定母乳中低聚糖的含量，测定结果如表5所示。
表5人初乳中低聚糖测定结果
注：“-”表示没有报道。
试验结果见表5，表明12种母乳低聚糖的测定结果均在查阅文献所得的测定范围之内，故该测定方法可用于母乳低聚糖的测定。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。