一种基于MALDI‑TOF‑MS的死宰肉鉴别方法及系统与流程

本发明涉及肉质鉴别方法及系统。更具体地，涉及一种基于maldi-tof-ms的死宰肉鉴别方法及系统。
背景技术：
：随着现代生活水平的提高，人们对优质肉类的需求渐益旺盛。相对于统一收购屠宰活体动物并经过检疫进入市场的活宰肉而言，死宰肉是一种私自收购屠宰病死动物而逃避检疫进入市场的肉类，其具有生物性危害、有毒有害物质危害和药物残留危害，对人们的生活质量造成了极大的威胁。因此，对于市场上死宰肉的检验和鉴别收到越来越广泛的关注。以死宰猪肉为例，目前市场上病死猪肉的检验法主要有感官检验和实验室检验两种方法。其中，感官检验往往基于经验而不能准确有效地鉴别出死宰肉，实验室检验主要包括硫酸铜蛋白质沉淀法、过氧化物酶反应法、ph值试纸法和细菌内毒素呈色法等。发表的相关文献主要有《4种方法快速检测病死猪肉的对比试验》、《细菌毒素氧化呈色法和过氧化物酶法检验病害猪肉的比较》和《病死猪肉的快速检验与处理》等。由于造成死宰猪非正常死亡的原因很多，包括各种疫病(如猪瘟、猪丹毒、猪肺疫、猪流行性腹泻、猪副伤寒等)或者摄入有毒物质(农药、灭鼠药、重金属等)，现有的检测方法由于其检测原理上的限制，很容易受周围环境或者样本自身因素的影响，检测方法的重现性差，不能有效鉴别死宰猪，方法的准确率仅为80％左右。另外，受肉类被检样存放日期、存放环境、取样部位、样本含水量等因素制约，产生的检测结果也会不同，容易造成假阳性或者假阴性结果，所以方法的重现性较差。由于非正常死亡的猪通常会产生一些异常的代谢，导致它的细胞、组织或血液等代谢组学(如氨基酸代谢、脂代谢等)或蛋白组学与活宰猪有明显差异，如免疫igg异常、血红蛋白异常、过氧化物酶异常等等。因此，死宰猪与活宰猪的代谢组学和蛋白组学差异较大。其中，代谢组学对生物体病理、生理刺激或基因修饰产生的代谢物质的质和量的动态变化进行，注重动物的体液和组织；蛋白组学通过比较正常和病理情况下生物体细胞、组织或体液中蛋白质在组成成分、表达水平上的差异进行研究，主要研究生物体的特异性蛋白(群)，如抗原、受体、酶等。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms，matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其无论是在理论上还是在设计上都是十分简单和高效的。其检测仪器主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源(maldi)和飞行时间质量分析器(tof)。其中，maldi是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定，其原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。tof的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(m/z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。maldi-tof由于其特有的软电离方式离子源，特别适用于检测蛋白、多肽、脂质等生物大分子。maldi-tof-ms具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用因此，为了解决现有检测方法重现性差、准确率低的问题，建立科学、高效、准确的鉴别方法及系统，需要提供一种基于maldi-tof-ms的死宰肉鉴别方法及系统。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一种基于maldi-tof-ms的死宰肉鉴别方法，借助质谱仪在分子水平上查找死宰肉与活宰肉的代谢组学和蛋白组学差异，最大限度地降低环境因素和样本自身因素干扰。为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：一种基于maldi-tof-ms的死宰肉鉴别方法，包括：制备样本集，样本集包括训练样本集、检验样本集和待测样本集；应用maldi-tof-ms对样本集进行测定，得到对应质谱图；基于训练样本集和检验样本集的质谱图建立神经网络分类器；应用神经网络分类器对待测样本集中的样本进行分类，得出鉴定结果。优选地，制备样本集包括样本前处理：取备检肉样；去除所述备检肉样中的脂肪和结缔组织；进行均质、过滤和静止操作；除去表层的油脂；所得上清液即为肉浸液样本。优选地，训练样本集包括活宰肉训练样本子集和死宰肉训练样本子集。进一步优选地，基于训练样本集和检验样本集的质谱图建立神经网络分类器，包括：对训练样本集和检验样本集的质谱图进行数值化，得到对应的质谱图数据；用训练样本集质谱图数据对神经网络进行训练，构建神经网络分类器；用检验样本集质谱图数据对神经网络分类器进行检验；若神经网络分类器能对检验样本集进行正确分类，则执行下一步骤；若否，则返回上一步骤；得到神经网络分类器。进一步优选地，对训练样本集和检验样本集的质谱图进行数值化，包括：将每一样本的质谱图分为n等份，每份对应的统计值为bi，其中，i、n为自然数且i≤n；令bi＝∑ij，计算bi的值，其中，m为第i份质谱图内质谱峰的个数，j、m为自然数且j≤m，ij为第i份质谱图内第j个质谱峰的强度，∑ij为第i份质谱图内所有质谱峰的强度的总和。进一步优选地，用训练样本集质谱图数据对神经网络进行训练，包括：对活宰肉训练样本子集每个样本的bi的值进行比较，得出活宰肉训练样本子集的bi的值的范围；对死宰肉训练样本子集每个样本的bi的值进行比较，得出死宰肉训练样本子集的bi的值的范围；比较活宰肉训练样本子集的bi的值的范围和对应活宰肉训练样本子集的bi的值的范围，确定特异性值；基于所述特异性值对样本进行分类，得出鉴定结果。优选地，用检验样本集质谱图数据对神经网络进行检验，包括：检验样本集包括活宰肉检验样本子集和死宰肉检验样本子集；判断神经网络分类器对活宰肉检验样本子集分类是否正确；及判断神经网络分类器对死宰肉检验样本子集分类是否正确。本发明的另一个目的在于提供一种基于maldi-tof-ms的死宰肉鉴别系统。一种基于maldi-tof-ms的死宰肉系统，包括：样本制备单元，用于制备样本集，所述样本集包括训练样本集、检验样本集和待测样本集；质谱分析单元，用于应用maldi-tof-ms对所述样本集进行测定，得到对应质谱图；神经网络单元，用于基于训练样本集和检验样本集的质谱图建立神经网络分类器；分类鉴定单元，应用所述神经网络分类器对待测样本集中的样本进行分类，得出鉴定结果。优选地，训练样本集包括活宰肉训练样本子集和死宰肉训练样本子集。进一步优选地，神经网络单元包括：数值化模块，对所述训练样本集和检验样本集的质谱图进行数值化，得到对应的质谱图数据；训练模块，用训练样本集质谱图数据对神经网络分类器进行训练；检验模块，用检验样本集质谱图数据对神经网络分类器进行检验。本发明的有益效果如下：本发明的一种基于maldi-tof-ms的死宰肉鉴别方法及系统，借助质谱仪在分子水平上查找死宰肉与活宰肉的代谢组学和蛋白组学差异，通过神经网络分类器的训练学习和检验，最大限度地降低环境因素和样本自身因素干扰，检测过程具有高稳定性、灵敏度和准确度，检测结果具有良好的重现性，是一种科学、准确、高效的死宰肉鉴别方法及系统。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。图1示出一种基于maldi-tof-ms的死宰肉鉴别方法流程图。图2示出样本制备方法流程图。图3示出建立神经网络分类器方法流程图。图4示出猪肉样本的质谱图的局部放大图。具体实施方式为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。不同于常规的检测方法，本发明是一种基于maldi-tof-ms的死宰肉鉴别方法及系统，借助质谱仪在分子水平上查找死宰肉与活宰肉的代谢组学和蛋白组学差异，最大限度地降低环境因素和样本自身因素干扰。如图1所示，一种基于maldi-tof-ms的死宰肉鉴别方法，包括以下步骤：s1：制备样本集，样本集包括训练样本集、检验样本集和待测样本集。训练样本集包括活宰肉训练样本子集和死宰肉训练样本子集。如图2所示，本发明中，制备样本集包括样本前处理：s101：取备检肉样；s102：去除所述备检肉样中的脂肪和结缔组织；s103：进行均质、过滤和静止操作；s104：除去表层的油脂；s105：所得上清液即为肉浸液样本。应注意的是，样本集中样本的制备只要能够得到能够应用maldi-tof-ms进行测定的样本即可。s2：应用maldi-tof-ms对样本集进行测定，得到对应质谱图。本发明中检测仪器主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源(maldi)和飞行时间质量分析器(tof)。其中，maldi是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定，其原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。tof的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(m/z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。s3：基于训练样本集和检验样本集的质谱图建立神经网络分类器，如图3所示，具体包括以下步骤：s301：对训练样本集和检验样本集的质谱图进行数值化，得到对应的质谱图数据，具体地：将每一样本的质谱图分为n等份，每份对应的统计值为bi，其中，i、n为自然数且i≤n；令bi＝∑ij，计算bi的值，其中，m为第i份质谱图内质谱峰的个数，j、m为自然数且j≤m，ij为第i份质谱图内第j个质谱峰的强度，∑ij为第i份质谱图内所有质谱峰的强度的总和。s302：用训练样本集质谱图数据对神经网络进行训练，构建神经网络分类器，具体地：对活宰肉训练样本子集每个样本的bi的值进行比较，得出活宰肉训练样本子集的bi的值的范围；对死宰肉训练样本子集每个样本的bi的值进行比较，得出死宰肉训练样本子集的bi的值的范围；比较活宰肉训练样本子集的bi的值的范围和对应活宰肉训练样本子集的bi的值的范围，确定特异性值；基于所述特异性值对样本进行分类，得出鉴定结果。s303：用检验样本集质谱图数据对神经网络进行检验；若神经网络分类器能对检验样本集进行正确分类，则执行下一步骤；若否，则返回上一步骤。具体地：检验样本集包括活宰肉检验样本子集和死宰肉检验样本子集；判断神经网络分类器对活宰肉检验样本子集分类是否正确；及判断神经网络分类器对死宰肉检验样本子集分类是否正确。s304：得到神经网络分类器。s4：应用神经网络分类器对待测样本集中的样本进行分类，得出鉴定结果。下面以猪肉为例，对上述方法进行详细说明。s1：制备样本集，该样本集包括训练样本集、检验样本集和待测样本集。训练样本集包括活宰猪训练样本子集和死宰猪训练样本子集。本发明中例如选定20000个已知猪肉样本作为训练样本集进行神经网络训练，其中活宰猪肉样本9500个，死宰猪肉10500个。本发明中，样本集中样本制备为制备肉浸液，提取样本中的多肽、蛋白等，包括以下步骤：s101：取大于50g的被检肉样，例如可选择通脊肉、腹壁肉、臂头肌、臂二头肌、臂中肌、半腱肌等；s102：去除所述备检肉样中的脂肪和结缔组织；s103：被检肉样至无菌带滤网的均质袋中，加入10倍量的双蒸水，在拍打式均质仪上拍打数分钟，取下均质袋，过滤，滤液于4℃下静置2小时；s104：用吸管去除表层的油脂；s105：所得上清液即为肉浸液样本。s2：对上述选定的20000个已知猪肉样本应用maldi-tof-ms对样本集进行测定，得到对应质谱图。本发明中，采用quantof型maldi-tof质谱仪。s3：基于训练样本集和检验样本集的质谱图建立神经网络分类器，具体包括以下步骤：s301：对训练样本集和检验样本集的质谱图进行数值化，得到对应的质谱图数据，具体地：将每一样本的质谱图分为n＝700等份，每份对应的统计值为bi，i、n为自然数且i≤n；令bi＝∑ij，计算bi的值，其中，m为第i份质谱图内质谱峰的个数，j、m为自然数且j≤m，ij为第i份质谱图内第j个质谱峰的强度，∑ij为第i份质谱图内所有质谱峰的强度的总和，每个样本数据对应700个bi值。本发明中猪肉样本的质谱图质量范围从2000到50000，图4是猪肉样本的质谱图的局部放大图，通过上述方法进行计算：b89是8047和8102两个质谱峰的强度之和；b90是8123、8157和8164三个质谱峰的强度之和。b89＝0.00033+0.00007＝0.0004；b90＝0.00009+0.00013+0.0001＝0.00032。同理，依次分别计算统计值b1,b2……b700。s302：用训练样本集质谱图数据对神经网络分类器进行训练，具体地：对活宰肉训练样本子集每个样本的bi的值进行比较，得出活宰肉训练样本子集的bi的值的范围；对死宰肉训练样本子集每个样本的bi的值进行比较，得出死宰肉训练样本子集的bi的值的范围；比较活宰肉训练样本子集的bi的值的范围和对应活宰肉训练样本子集的bi的值的范围，确定特异性值；基于所述特异性值对样本进行分类，得出鉴定结果。本发明中，将20000个猪肉样本数据作为训练样本集，按照活宰猪肉和死宰猪肉分为两个子集，用于网络训练，构建分类器。其中，9500个活宰猪肉数据通过网络训练，共9500组700个bi值比较计算，确定活宰猪肉集的特性。以b1为例进行说明如下：第一步，比较9500组b1值，确定活宰猪肉集的b1值范围，然后依次比较确定b2,b3,b4……b700的范围；10500个死宰猪肉数据，同样确定700个bi值的范围。第二步，第一步中确定的两组700个bi数值范围再次比较，确定特异性和非特异性bi值，如b100<a时(a为大于零的数字)，必为活宰猪肉，或者活宰猪肉的b200为0，死宰猪肉的b200不为0，那么b100、b200均为特异性值；b150在两类子集中的数值重叠较多，则b150为非特异性值，b150值不能为我们分类猪肉样本提供可靠信息。s303：用检验样本集质谱图数据对神经网络分类器进行检验；若神经网络分类器能对检验样本集进行正确分类，则执行下一步骤；若否，则返回上一步骤。具体地：检验样本集包括活宰肉检验样本子集和死宰肉检验样本子集；判断神经网络分类器对活宰肉检验样本子集分类是否正确；及判断神经网络分类器对死宰肉检验样本子集分类是否正确。s304：得到神经网络分类器。s4：应用神经网络分类器对待测样本集中的样本进行分类，得出鉴定结果。鉴别未知样本时，样本经前处理后通过maldi-tof测定得到该样本质谱图，质谱图数据转换为700个bi值，将它们输入神经网络分类器，输出结果，实现鉴别。应说明的是，应用本发明中的死宰肉鉴别方法及系统时，鉴定准确率与训练样本集直接相关，训练样本集越多，其准确率越接近100％。当前我们使用20000个样本的大训练集，避免了低样本不能体现共性的缺点，而且样本集会适时补充样本数量，实际样本鉴别准确率将维持在很高的水平。下面结合具体实验的多个实例进行说明在下述实例中，用已知猪肉样本验证鉴别方法，鉴别猪肉样本300批次，其中活宰猪样本180批次，来自某定点屠宰加工企业；死宰猪样本120批次，来自8个养猪场患病死亡猪。每批次样品重复鉴别6个，共鉴别1800个样本。其中，120批次死宰猪共720个样本全部鉴别为死宰猪，鉴别准确率为100％；180批次活宰猪共1080个样本，其中有1080个样本鉴别为活宰猪，其鉴别准确率为100％，总鉴别准确率为100％。实例1(1)制备肉浸液。从某定点屠宰加工企业获取活宰猪肉样本20批次，每批次样本平行测定6个，共120样本。每个样本(选择通脊肉、腹壁肉、臂头肌、臂二头肌、臂中肌、半腱肌等)除去脂肪和结缔组织后，称取25g至无菌带滤网的均质袋中，加入250ml双蒸水，在拍打式均质仪上拍打2分钟(拍打速率为4次/秒)，取下均质袋，过滤约50ml至离心管中，4℃下静置2小时，用吸管去除表层的油脂，得到肉浸液。(2)maldi-tof测定。肉浸液与芥子酸基质液(sa)等体积混合，点样，每个靶点2μl。干燥结晶后放入maldi-tof仪，扫描测定，得到质谱图。测定参数如下：测定模式正离子模式激光能量8μj聚焦质量2500da扫描范围2,000-50,000m/z(3)样本鉴别。质谱图数据经预处理后进入分类器分析，得到鉴别结果：120个样本均被鉴别为活宰猪肉，鉴别准确率为100％。实例2(1)制备肉浸液。从2个养猪场得到患病死亡猪肉15批次，每批次样本平行测定6个，样本数为90。每个样本(选择通脊肉、腹壁肉、臂头肌、臂二头肌、臂中肌、半腱肌等)除去脂肪和结缔组织后，称取10g至无菌带滤网的均质袋中，加入100ml双蒸水，在拍打式均质仪上拍打3分钟(拍打速率为4次/秒)，取下均质袋，过滤约50ml至离心管中，4℃下静置2小时，用吸管去除表层的油脂，得到肉浸液。(2)maldi-tof测定。肉浸液与芥子酸基质液(sa)等体积混合，点样，每个靶点1μl。干燥结晶后放入maldi-tof仪，扫描测定，得到质谱图。测定参数如下：测定模式正离子模式激光能量10μj聚焦质量3000da扫描范围2,000-50,000m/z(3)样本鉴别。质谱图数据经预处理后进入分类器分析，得到鉴别结果：90个样本均被鉴别为死宰猪肉，鉴别准确率为100％。实例3(1)制备肉浸液。共获取猪肉样本30批次，其中15批次是从4个养猪场得到的患病死亡猪肉，15批次是从河北省内某定点屠宰场得到的活宰猪，每批次样本平行测定6个，样本数为180。每个样本(选择通脊肉、腹壁肉、臂头肌、臂二头肌、臂中肌、半腱肌等)除去脂肪和结缔组织后，称取20g至无菌带滤网的均质袋中，加入200ml双蒸水，在拍打式均质仪上拍打2分钟(拍打速率为4次/秒)，取下均质袋，过滤约50ml至离心管中，4℃下静置2小时，用吸管去除表层的油脂，得到肉浸液。(2)maldi-tof测定。肉浸液与芥子酸基质液(sa)等体积混合，点样，每个靶点2μl。干燥结晶后放入maldi-tof仪，扫描测定，得到质谱图。测定参数如下：测定模式正离子模式激光能量10μj聚焦质量3000da扫描范围2,000-50,000m/z(3)谱图鉴别谱图进入分类器分析后，得到鉴别结果：90个活宰猪肉样本均被鉴别为活宰猪肉，90个死宰猪肉样本均被鉴别为死宰猪肉，鉴别准确率为100％。综合3次实例，总鉴别准确率为100％。本发明鉴别系统稳定，重现性好，准确率高。本发明可为动物检疫、工商、质监、食品药品监督管理提供高效、稳定、准确的死宰肉鉴别方法及系统。本发明还公开一种基于maldi-tof-ms的死宰肉系统，包括：样本制备单元，用于制作样本集，所述样本集包括训练样本集、检验样本集和待测样本集，训练样本集包括活宰肉训练样本子集和死宰肉训练样本子集；质谱分析单元，用于应用maldi-tof-ms对所述样本集进行测定，得到对应质谱图；神经网络单元，用于基于训练样本集和检验样本集的质谱图建立神经网络分类器，具体包括：数值化模块，对所述训练样本集和检验样本集的质谱图进行数值化，得到对应的质谱图数据；训练模块，用训练样本集质谱图数据对神经网络分类器进行训练；检验模块，用检验样本集质谱图数据对神经网络分类器进行检验；及分类鉴定单元，应用所述神经网络分类器对待测样本集中的样本进行分类，得出鉴定结果。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。当前第1页12