本发明涉及对那非类和拉非类成分的检测领域，具体涉及一种pde-5抑制剂胶体金免疫层析试纸条及其制备和使用方法。
背景技术：
5型磷酸二酯酶(pde-5)属于环核苷酸水解酶家族，主要存在于阴茎海绵体、平滑肌及血小板中，能特异性地与环鸟苷酸结合，是阴茎中环鸟苷酸代谢失活的主要同工酶。pde-5抑制剂可选择性地抑制存在于阴茎海绵体的pde-5的活性，使局部环鸟苷酸浓度维持在较高的水平，促进海绵体平滑肌松弛、血流量增加达到治疗阳痿的效果。目前，已获准上市的pde-5抑制剂主要包括西地那非、伐地那非和他达拉非。
近年来，世界各国的科研机构和药品检验部门，不断报道在天然保健品或中成药中检出了违法添加的pde-5抑制剂，其中不仅包括三种已经获准上市的药物，而且还包括它们进行了轻微结构改造的类似物。获准上市的pde-5抑制剂药品是处方药，会产生不同程度的副作用。但消费者在不知情的情况下服用违法添加的pde-5抑制剂，主要有以下几个方面的风险：
①pde-5抑制剂与硝酸酯药物相互作用会导致严重低血压；②pde-5抑制剂的类似物没有经过临床研究，存在未知危险因素；③违法添加的pde-5药物剂量往往超过安全使用剂量，对身体健康构成严重威胁。
目前，检测pde-5抑制剂的方法主要有高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法，核磁共振色谱法等等。但是这些方法设备昂贵、运行费用高、操作过程复杂，不适合在基层部门广泛开展，普通消费者也无法使用。另外，对于新出现的pde-5抑制剂药物的结构类似物，往往会规避常规方法的检验，产生假阴性的结果。
免疫检测方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、操作简单、成本低廉，无需借助昂贵的设备等优点，特别是胶体金免疫层析试纸条的出现，更加适合基层部门和普通消费者使用。
目前，市场上已有部分检测pde-5抑制剂的胶体金免疫层析试纸条(如西地那非)，但大部分是只能同时检测一种成分，给实际应用带来了不便。
技术实现要素：
本发明的目的是针对以上现有技术存在的缺陷，提供一种可同时检测较多种那非类和拉非类成分的胶体金免疫层析试纸条，可用于壮阳类保健品及中成药等产品中那非类和拉非类成分的快速检测和初筛。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种pde-5抑制剂胶体金免疫层析试纸条，该试纸条包括pvc底板、样品垫、金标垫、检测线、控制线、硝基纤维素膜、吸水垫；所述样品垫、金标垫、检测线、控制线、硝基纤维素膜、吸水垫均设置在pvc底板的上方，所述样品垫设置在pvc底板的一端的边缘，金标垫设置在样品垫内侧并与样品垫部分重叠；吸水垫设置在pvc底板的另一端，硝基纤维素膜设置在金标垫与吸水垫之间并分别与两者部分重叠；检测线在硝基纤维素膜上靠近金标垫的一端，控制线喷涂在靠近吸水垫的一端，所述样品垫和金标垫为玻璃纤维膜；金标垫上包被有胶体金标记的那非类通用抗体和拉非类通用抗体混合物；所述检测线包被那非类通用半抗原(nfa)与载体蛋白的偶联物，以及拉非类通用半抗原(lfa)与载体蛋白的偶联物；所述控制线上包被兔抗鼠或羊抗鼠igg抗体；所述吸水垫为滤纸；所述那非类通用半抗原(nfa)如式ⅰ所示，所述拉非类通用半抗原(lfa)如式ⅱ所示。
本发明所述用于检测那非类和拉非类成分的pde-5抑制剂胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1.制备通用半抗原-载体蛋白偶联物：将那非类通用半抗原(nfa)或拉非类通用半抗原(lfa)与牛血清白蛋白(bsa)或卵清白蛋白(ova)，通过碳二亚胺法、活化酯法、混合酸酐法、重氮化法或戊二醛法等方法进行偶联，制备通用半抗原-bsa偶联物与通用半抗原-ova偶联物；
2.制备那非类通用抗体和拉非类通用抗体：将通用半抗原-bsa偶联物多次免疫小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞在体外进行融合，制备杂交瘤细胞，将阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔收集腹水，或以体外细胞培养的收集上清液的方式制备那非类通用抗体和拉非类通用抗体；
3.制备胶体金：以柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，胶体金溶液中胶体金颗粒直径在20～40nm之间；
4.胶体金标记抗体：在胶体金溶液中加入那非类通用抗体和拉非类通用抗体，其中那非类通用抗体和拉非类通用抗体的比例为1:1，加入上述两种抗体的量为每毫升胶体金溶液中加入1μg～20μg，加入后混匀，通过离心纯化、浓缩，制备成胶体金标记的那非类通用抗体和拉非类通用抗体混合物；
5.将胶体金标记的那非类通用抗体和拉非类通用抗体混合物喷涂并固定在金标垫上，将nfa-ova偶联物和lfa-ova偶联物包被在检测线上(称作包被抗原)，将兔抗鼠或羊抗鼠igg抗体包被在控制线上，并充分干燥；
6.将硝基纤维素膜、金标垫、样品垫、吸水垫依次粘合在pvc底板上，切成条状，即制成检测那非类和拉非类成分的胶体金免疫层析试纸条。
本发明所述的用于检测那非类和拉非类成分的pde-5抑制剂胶体金免疫层析试纸条的使用方法如下：
样品经前处理后，用提取溶剂提取，提取溶剂为一定浓度的乙醇水溶液或磷酸盐缓冲液或两者混合物，得到样品溶液。将适量样品溶液滴加到样品垫上，样品溶液将会向吸水垫端移动，待一段时间后，根据检测线和控制线的显色情况，判断样品中是否含有那非类或拉非类成分，判断方法如下：
(1)检测线显红色，控制线显红色——阴性结果，样品中不含那非类和拉非类成分；
(2)检测线不显红色，控制线显红色——阳性结果，样品中含有那非类或拉非类成分；
(3)无论检测线显不显红色，控制线不显红色——试纸条失效。
本发明所述的检测那非类和拉非类成分的胶体金免疫层析试纸条的检测原理如下：
滴加待测样品溶液后，样品溶液在各种膜的毛细作用下，沿着样品垫向吸水垫端移动，移动到金标垫时，样品溶液溶解胶体金标记的抗体，当样品中含有待测物时，将与胶体金标记的抗体结合并一起向吸水垫端移动，到达固定有包被抗原的检测线时，包被抗原将和待测物竞争结合胶体金标记抗体，样品中待测物含量越高，竞争越明显，检测线上的包被抗原与胶体金标记抗体结合越少，当包被抗原所结合的胶体金标记抗体少于一定数量时，检测线将不显红色，无论样品中含不含有待测物，过量的胶体金标记抗体或其与待测物结合物都会与控制线的兔抗鼠或羊抗鼠igg抗体结合，形成一条红色线，若控制线不显红色，则说明试纸条失效，需要重新更换试纸条进行检测。
本发明所述的检测那非类和拉非类成分的胶体金免疫层析试纸条具有以下优势：
(1)本发明首次采用检测范围更宽的那非类通用半抗原nfa，其具有与大部分那非类成分相似的通用结构，制成的那非类通用抗体可对大部分那非类成分进行特异性识别，检测范围宽，灵敏度高；
(2)本发明首次采用拉非类通用半抗原lfa制备通用抗体，扩大了拉非类成分的检测范围；
(3)本发明首次将那非类通用抗体与拉非类通用抗体一起包被于金标垫上，且将nfa-ova偶联物和lfa-ova偶联物共同包被于检测线，可同时对那非类和拉非类成分进行检测，大大提高了检测效率。
附图说明
图1为本发明胶体金免疫层析试纸条的结构示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
在本发明中，dmso为二甲基亚砜，nhs为n-羟基琥珀酰亚胺，edc为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，nfa为那非类通用半抗原，lfa为拉非类通用半抗原，pbs为磷酸缓冲盐溶液；bsa为牛血清白蛋白。
如图1所示：一种pde-5抑制剂胶体金免疫层析试纸条，该试纸条包括pvc底板1、样品垫2、金标垫3、检测线4、控制线5、硝基纤维素膜6、吸水垫7；所述样品垫2、金标垫3、检测线4、控制线5、硝基纤维素膜6、吸水垫7均设置在pvc底板1的上方，所述样品垫2设置在pvc底板1的一端的边缘，金标垫3设置在样品垫2内侧并与样品垫2部分重叠；吸水垫7设置在pvc底板1的另一端，硝基纤维素膜6设置在金标垫3与吸水垫7之间并分别与两者部分重叠；检测线4在硝基纤维素膜6上靠近金标垫3的一端，控制线5喷涂在靠近吸水垫7的一端。
进一步的，所述样品垫2和金标垫3为玻璃纤维膜，金标垫3上包被有胶体金标记的那非类通用抗体和拉非类通用抗体混合物；
进一步的，所述检测线4包被那非类通用半抗原与载体蛋白的偶联物，以及拉非类通用半抗原与载体蛋白的偶联物；
进一步的，所述控制线5上包被兔抗鼠或羊抗鼠igg抗体；
进一步的，所述吸水垫7为滤纸；所述那非类通用半抗原(nfa)如式ⅰ所示，所述拉非类通用半抗原(lfa)如式ⅱ所示：
本发明的具体实施例如下：
实施例1：通用半抗原-载体蛋白偶联物的制备：
以nfa-bsa偶联物的制备为例：本发明所采用的那非类通用半抗原中含有羧基基团，采用碳二亚胺法，使羧基与载体蛋白中的氨基结合反应，将那非类通用半抗原与载体蛋白偶联，具体操作如下：称取0.1069gnfa，0.0345gnhs和0.0575gedc，溶于3mldmso中，磁力搅拌过夜，得到edc溶液。称取0.12gbsa，溶解在5ml浓度为0.1mol/l，ph7.0的碳酸氢钠缓冲液中，得到bsa溶液，在搅拌状态下，将edc溶液缓慢滴加到bsa溶液中，反应过夜，所得溶液用蒸馏水于4℃透析5天，每天每隔8h换一次透析液，最后将溶液-20℃冷冻干燥，即得nfa-bsa偶联物。
实施例2：应用实施例：
取市售壮阳类保健品(胶囊剂)约1/2粒，内容物加入5％乙醇水溶液振荡提取，放置分层，吸取上清液，滴加到那非类和拉非类胶体金免疫层析试纸条样品垫上，反应5～10min，观察检测线和控制线的显色情况，若检测线和控制线均显红色，则结果为阴性，表明样品中不含那非类成分和拉非类成分；若检测线不显红色，控制线显红色，则结果为阳性，表明样品中含有那非类或拉非类成分；若控制线不显红色，说明试纸条失效，需使用新的试纸条进行检测。
实施例3：灵敏度测试：
用本发明的试纸条对9种那非类成分和3种拉非类成分进行检测，每种成分均配制成不同的浓度，如表1所示：
表1试纸条灵敏度及特异性测试结果
结果显示，西地那非、红地那非、伐地那非、伪伐地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、那红地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非等9种那非类成分检测结果均为阳性，最低检测限在0.2mg/kg～2mg/kg之间3种拉非类成分中，他达拉非、氨基他达拉非、二乙氨基前他达拉非的检测结果均为阳性，最低检测限在0.1mg/kg～5mg/kg之间，说明本发明的试纸条可对多数那非类成分和拉非类成分进行检测。
实施例4：特异性测试：
用本发明的试纸条对4种减肥类保健品非法添加化学成分以及5种降糖类保健品非法添加化学成分进行检测，结果如表1所示，西布曲明、去甲基西布曲明、双去甲基西布曲明、酚酞等4种减肥类保健品非法添加化学成分以及格列本脲、格列美脲、罗格列酮、苯乙双胍、二甲双胍等5种降糖类保健品非法添加化学成分的检测结果均为阴性，说明本发明的试纸条可对壮阳类保健品中非法添加的那非类和拉非类成分进行特异性检测，而对其它类型的成分无特异性反应。
实施例5：稳定性测试；
将用本发明方法制作好的试纸条装入密封袋内，内置干燥剂，置于45℃烘箱内保存，分别于7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天取出，检测试纸条的稳定性。结果显示，45℃保存7天、14天、21天、28天、35天、42天，检测结果均无明显变化。45℃保存49天，金标垫上胶体金标记的抗体出现复溶现象，检测线和控制线的颜色变浅，灵敏度下降。45℃保存到56天，检测限颜色已经很微弱。45℃保存49天，相当于常温保存18个月。