一种检测呋喃唑酮代谢物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种检测呋喃唑酮代谢物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法与应用，其特别适于动物组织中呋喃唑酮代谢物残留的检测，属于免疫学技术领域和兽药残留分析技术领域。

背景技术：

呋喃唑酮(Furazolidone，FZD)，又名痢特灵，是一种硝基呋喃类药物，对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌有抑制作用，作用于微生物酶系统，抑制乙酰辅酶A，干扰微生物糖代谢，从而起到抑菌作用。广泛用于水产和禽类，用以治疗菌痢、肠炎、球虫等，以及养殖鱼的疥疮、赤鳍病、溃疡等。因其杀菌能力强，抗菌谱广，不易产生耐药性，口服吸收迅速，与其他抗生素无交叉耐药性等优点，曾广泛应用于临床。呋喃唑酮具有很强的副作用，而且在动物体内很快就代谢为3-氨基-2-唑烷酮(AOZ)，AOZ在胃酸条件下直接代谢成为具有强烈致突变性和致癌性的β-羟乙基肼，对人体健康与生态平衡具有潜在威胁。目前，欧盟、美国、日本、中国等规定禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗生素，我国农业部文件农牧发[2002]1号文件规定食品性动物中呋喃唑酮的检出限为不得检出。

目前有关呋喃唑酮残留的检测技术主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)及免疫分析技术，前三种方法灵敏、准确，但操作繁琐，对实验设备和技术要求较高，不适合大批量样品的快速检测。免疫分析方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析法(GICA)，具有灵敏度高、特异性好、成本低、操作方便等特点，适于大批量样品筛选。GICA作为一种新的免疫学检测方法，既有免疫学方法的特异性，又有简便快速、不需仪器的特点，其在医学、动植物检疫、食品检测等多领域已得到了广泛应用。开发呋喃唑酮胶体金试纸条有助于AOZ残留快速、准确的检测，有效遏制其在水产品中的违规使用及残留超标问题，提高人民群众水产品餐桌质量安全水平。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种检测呋喃唑酮代谢物的胶体金免疫层析试纸条，该胶体金免疫层析试纸条具有操作简单，快速，适合大批量样品初筛的优点。此外，本发明进一步提供该检测呋喃唑酮代谢物的胶体金免疫层析试纸条的制备方法与应用。

本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。

一种检测呋喃唑酮代谢物的胶体金免疫层析试纸条，该检测试纸条由底板、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫组成，试纸两端设有保护膜，所述样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫依次粘贴于底板上；其中胶体金垫为吸附有胶体金标记的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体，包被膜上含有用AOZ代谢物偶联载体蛋白的预包被检测线(T线)，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液预包被的质控线(C线)，两条线竖直平行排列。

上述胶体金免疫层析试纸条，呋喃唑酮代谢物单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，由CCTCC NO：C2016140的杂交瘤细胞株AOZ-4G3产生。该杂交瘤细胞株被命名为杂交瘤细胞株AOZ-4G3，于2016年7月31日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO:C2016140。

上述胶体金免疫层析试纸条，所述呋喃唑酮代谢物单克隆抗体由呋喃唑酮代谢物抗原产生，其为由呋喃唑酮代谢物与载体蛋白采用碳二亚胺法合成的偶联物，包括免疫原与检测原；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清白蛋白、免疫血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白；免疫原优选载体为牛血清白蛋白，检测原优选载体为卵清蛋白；

上述胶体金免疫层析试纸条，所述底板为PVC条或其它不吸水的硬质材料；所述样品垫和胶体金垫由玻璃纤维棉制成；所述吸水垫由吸水滤纸制成；所述包被膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为不透明的胶膜。

本发明所述的胶体金层析试纸条制备方法，包括如下步骤：

(1)制备呋喃唑酮代谢物抗原工作液：

(a)呋喃唑酮代谢物衍生化：取0.25g AOZ，用2mL左右的甲醇于室温下搅拌使之溶解；取0.15g 3-羧基苯甲醛，用2mL甲醇使之溶解，在搅拌下缓慢滴入上述AOZ溶液中，室温下搅拌反应5h，过滤，烘干滤渣即得呋喃唑酮代谢物的衍生物CPAOZ；

(b)免疫原的合成：称取50mg的牛血清白蛋白(BSA)溶于pH值7.4的1mL 0.1mol/L的PBS中，加入N,N-二甲基酰胺(DMF)1mL，搅拌溶解；再将步骤(a)所得的CPAOZ 8mg溶于1mLDMF溶液中，搅拌下加入二环己基亚胺(DCC)14mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)6mg，4℃下密封搅拌过夜，8000r/min离心15分钟，收集上清液装入透析袋中，4℃条件下用pH值7.4的0.01mol/L PBS透析3d，每天换液3-4次，得CPAOZ-BSA溶液；

(c)检测原的合成：称取40mg的卵清蛋白(OVA)溶于pH值7.4的1mL 0.1mol/L PBS中，加入N,N-二甲基酰胺(DMF)1mL，搅拌溶解；再将步骤(a)所得的CPAOZ 8mg溶于1mLDMF溶液中，搅拌下加入二环己基亚胺(DCC)14mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)6mg，4℃下密封搅拌过夜，8000r/min离心15分钟，收集上清液装入透析袋中，4℃条件下用pH值7.4的0.01mol/L PBS透析3d，每天换液3-4次，得CPAOZ-OVA溶液；

(2)制备呋喃唑酮代谢物单克隆抗体工作液：

(a)动物免疫：选择载体蛋白为牛血清白蛋白的免疫原，免疫6-8周龄的雌性Blab/c小鼠，间隔2周免疫1次，三次免疫后断尾取血测定效价和抑制率，选择结果最佳的小鼠准备融合；

(b)细胞融合：取步骤(a)选定的小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/O细胞进行融合，间接ELISA法测定上清液选取阳性高的孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立产生单一抗呋喃唑酮代谢物的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(c)单克隆抗体的大量制备：选取个体较大的雌性Blab/c小鼠，采用体内诱生腹水法，大量制备腹水，并通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水，分成小管，-20℃保存，得呋喃唑酮代谢物单克隆抗体；

(3)制备胶体金标记的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体：

将待标记的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体溶液10000r/min离心30min，取胶体金溶液10mL，用0.1mol/L K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2；取等量呋喃唑酮代谢物单克隆抗体溶液，磁力搅拌下与胶体金溶液混合，室温孵育15min，10000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用每升含10g BSA、0.5g叠氮钠、浓度为0.02mol/L的Na₂B₄O₇溶液稀释，即获得胶体金标记的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体，4℃保存备用；

(4)胶体金垫制备：按规格裁取玻璃纤维棉，将胶体金标记的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体用喷金仪均匀喷洒于玻璃纤维棉上，37℃干燥1h，密封，4℃保存备用；

(5)检测线和质控线的制备：将呋喃唑酮代谢物抗原放于喷金仪贮存池A，羊抗小鼠IgG溶液放于贮存池B，开机分别点射于膜中央，形成间距0.5cm的直线式隐形检测线和隐形质控线，自然干燥，密封，4℃保存备用；

(6)试纸条组装：将样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫按顺序依次粘贴于底板上，并在试纸条两端的表面粘贴保护膜，在切槽机上切割成试纸条。

上述胶体金层析试纸条在用于检测动物组织、尿液和牛奶中呋喃唑酮代谢物中的应用。

上述在用于检测呋喃唑酮代谢物的应用，包括如下步骤：

(1)样品前处理

(a)肉类、肝脏或水产品样品组织的前处理

组织匀浆后，称取2g于50ml离心管中，加入4mL去离子水，1mL 1mol/L盐酸溶液，振荡1min，再加入0.5mL对羧基苯甲醛，振荡1min；取出后加入0.5mol/L磷酸氢二钠溶液1mL，用1mol/L氢氧化钠溶液调节PH至7.5左右，振荡1min，加入5mL乙酸乙酯，振荡1min，5000rpm离心10min；移取上层乙酸乙酯层溶液于另一离心管中，水相再用5mL乙酸乙酯重复萃取两次，合并后氮气吹干；加入1ml正己烷，加盖振荡1min，然后加入0.5mL PBST缓冲液，振荡1min，5000rpm离心10min；吸取下层水相溶液用于分析；

(b)尿样前处理

将尿样5000rpm离心5min至清亮，取上清50ul进行检测；

(c)奶样前处理

取奶样2mL室温条件下5000rpm离心10min，取下层溶液加入4mL去离子水，1mL 1mol/L盐酸溶液，振荡1min，再加入0.5mL对羧基苯甲醛，振荡1min；取出后加入0.5mol/L磷酸氢二钠溶液1mL，用1mol/L氢氧化钠溶液调节PH至7.5左右，振荡1min，加入5mL乙酸乙酯，振荡1min，5000rpm离心10min；移取上层乙酸乙酯层溶液于另一离心管中，水相再用5mL乙酸乙酯重复萃取两次，合并后氮气吹干；加入1ml正己烷，加盖振荡1min，然后加入0.5mL PBST缓冲液，振荡1min，5000rpm离心10min；吸取下层水相溶液用于分析；

(2)用胶体金层析试纸条检测

从包装中取出所述检测呋喃唑酮代谢物的胶体金免疫层析试纸条，将样品端插入待测样品液中，插入深度不超过标记线，约10-20秒钟取出检测试纸条，水平放置，3-5分钟观察判定检测结果，10分钟以后结果无效；

(3)结果判定

(a)阳性如果包被膜上对应的质控区C位置显示一条棕红色线，检测区T位置不显示棕红色线，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有AOZ；

(b)阴性如果在包被膜上T、C位置显示有两天棕红色线，表示结果为阴性，说明在待测样品中不含AOZ；

(c)失效当质控区C不显示出棕红色条带，则无论检测区T显示出棕红色条带与否该试纸均判为无效。

本发明的呋喃唑酮代谢物胶体金层析试纸条的检测限为4μg/L，与其他3种硝基呋喃代谢物的衍生物CPAHD、CPSEM、CPAMOZ均不存在交叉反应，对样品的检测与高效液相色谱结果一致。用本发明胶体金层析试纸条检测呋喃唑酮代谢物的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1本发明所述呋喃唑酮代谢物单克隆抗体亲和力测定图

图2本发明所述呋喃唑酮代谢物单克隆抗体亚型测定图

图3本发明所述呋喃唑酮代谢物胶体金层析试纸条试纸剖面结构示意图

图4本发明所述呋喃唑酮代谢物胶体金层析试纸条试纸俯视结构示意图

图5本发明所述呋喃唑酮代谢物胶体金层析试纸条试纸结果判定图

本发明所述产生呋喃唑酮代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株AOZ-4G3，已于2016年7月31日送交中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)保藏，保藏号为CCTCC NO:C2016140。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，所列举的实施例不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一 本发明所述呋喃唑酮代谢物抗原的制备

(1)呋喃唑酮代谢物衍生化：取0.25g AOZ，用2mL左右的甲醇于室温下搅拌使之溶解；取0.15g 3-羧基苯甲醛，用2mL甲醇使之溶解，在搅拌下缓慢滴入上述AOZ溶液中，室温下搅拌反应5h，过滤，烘干滤渣即得呋喃唑酮代谢物衍生物CPAOZ；

(2)免疫原的合成：称取50mg的牛血清白蛋白(BSA)溶于pH值7.4的1mL 0.1mol/L的PBS中，加入N,N-二甲基酰胺(DMF)1mL，搅拌溶解；再将步骤(a)所得的CPAOZ 8mg溶于1mLDMF溶液中，搅拌下加入二环己基亚胺(DCC)14mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)6mg，4℃下密封搅拌过夜，8000r/min离心15分钟，收集上清液装入透析袋中，4℃条件下用pH值7.4的0.01mol/L PBS透析3d，每天换液3-4次，得CPAOZ-BSA溶液；

(3)检测原的合成：称取40mg的卵清蛋白(OVA)溶于pH值7.4的1mL 0.1mol/L PBS中，加入N,N-二甲基酰胺(DMF)1mL，搅拌溶解；再将步骤(a)所得的CPAOZ 8mg溶于1mLDMF溶液中，搅拌下加入二环己基亚胺(DCC)14mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)6mg，4℃下密封搅拌过夜，8000r/min离心15分钟，收集上清液装入透析袋中，4℃条件下用pH值7.4的0.01mol/L PBS透析3d，每天换液3-4次，得CPAOZ-OVA溶液。

实施例二 本发明所述呋喃唑酮代谢物单克隆抗体的制备

(1)动物免疫：载体蛋白为牛血清白蛋白的免疫原免疫6-8周龄的雌性Blab/c小鼠，间隔2周免疫1次，三免后断尾取血测定效价和抑制率，选择结果最佳的小鼠准备融合；

(2)细胞融合：取小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/O细胞，进行融合，间接ELISA法测定上清选取阳性高的孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立产生单一抗呋喃唑酮代谢物的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(3)单克隆抗体的大量制备：选取个体较大的雌性Blab/c小鼠，采用体内诱生腹水法，大量制备腹水，并通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水，分成小管，-20℃保存，得呋喃唑酮代谢物单克隆抗体。

实施例三 本发明所述呋喃唑酮代谢物单克隆抗体特性鉴定

1、亲和力测定

采用非竞争酶联免疫法测定呋喃唑酮代谢物单克隆抗体的亲和常数，结果如图1所示，亲和常数Ka＝1.6×10⁹L/mol。

2、亚型测定

采用购自Sigma公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒进行亚型测定，结果见图2所示，呋喃唑酮代谢物单克隆抗体亚型为IgG1。

3、效价测定

以1：40000稀释包被原包被检测板，将纯化后的单克隆抗体进行1:200，1:400，1:800，……1:800000稀释，加入到酶标板孔内，反应后加入HRP标记的羊抗鼠二抗，最后用TMB显色，结果显示纯化后的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体浓度为1mg/ml时的效价达1：1024000。

实施例四 本发明所述检测呋喃唑酮代谢物的胶体金层析试纸条

1、胶体金液制备：取100mL蒸馏水，煮沸5min，加入质量浓度为1％的氯金酸1mL和质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液1.5mL，继续搅拌加热，溶液最终经过灰色、酒红色至呈透亮的红色，冷却到室温，分别通过目测法、紫外分光光度法进行质量鉴定，合格的胶体金溶液4℃避光保存；

2、胶体金标记的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体的制备：将待标记的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体溶液10000r/min离心30min，取胶体金溶液10mL，用0.1mol/L K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2；取等量呋喃唑酮代谢物单克隆抗体溶液，磁力搅拌下与胶体金溶液混合，室温孵育15min，10000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用每升含10g BSA、0.5g叠氮钠、浓度为0.02mol/L的Na₂B₄O₇溶液稀释，即获得胶体金标记的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体，4℃保存备用；

3、胶体金垫制备：按规格裁取玻璃纤维棉，将金标抗体用喷金仪均匀喷洒于玻璃纤维棉上，37℃干燥1h，密封，4℃保存备用；

4、检测线和质控线的制备：将呋喃唑酮代谢物抗原放于喷金仪贮存池A，羊抗小鼠IgG溶液放于贮存池B，开机分别点射于膜中央，形成间距0.5cm的直线式隐形检测线T线和隐形质控线C线，自然干燥，密封，4℃保存备用；

5、试纸条组装：将样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫按顺序依次粘贴于底板上，并在试纸条两端的表面粘贴保护膜，在切槽机上切割成试纸条。

6、呋喃唑酮代谢物胶体金层析试纸条的结构，参见图3、图4。图中底板1用PVC板制成，样品垫2用玻璃纤维棉制成，胶体金垫3上吸附有抗呋喃唑酮代谢物单克隆抗体，包被膜4采用硝酸纤维素膜，吸水垫7用吸水滤纸制成，将编号2、3、4、7各层从右至左依次粘贴固定在底板1上，彼此交界处纤维互相交叉渗透。在包被膜4上设有隐形检测线5和隐形质控线6，隐形检测线用偶联呋喃唑酮代谢物的鸡卵白蛋白(OVA)溶液印制，隐形质控线用羊抗小鼠IgG抗体溶液印制，两条印迹平行排列成“︱︱”。8为覆盖在样品垫2和胶体金垫3上面的样品端保护膜，9为覆盖在吸水垫7上面的手柄端保护膜，在样品标记线右侧的保护膜上印有箭头及MAX字样。

实施例五 本发明所述胶体金层析试纸条检测样品中呋喃唑酮代谢物

(1)样品前处理

(a)肉类、肝脏或水产品样品组织的前处理

组织匀浆后，称取2g于50ml离心管中，加入4mL去离子水，1mL 1mol/L盐酸溶液，振荡1min，再加入0.5mL对羧基苯甲醛，振荡1min；取出后加入0.5mol/L磷酸氢二钠溶液1mL，用1mol/L氢氧化钠溶液调节PH至7.5左右，振荡1min，加入5mL乙酸乙酯，振荡1min，5000rpm离心10min；移取上层乙酸乙酯层溶液于另一离心管中，水相再用5mL乙酸乙酯重复萃取两次，合并后氮气吹干；加入1ml正己烷，加盖振荡1min，然后加入0.5mL PBST缓冲液，振荡1min，5000rpm离心10min；吸取下层水相溶液用于分析；

(b)尿样前处理

将尿样5000rpm离心5min至清亮，取上清50ul进行检测；

(c)奶样前处理

取奶样2mL室温条件下5000rpm离心10min，取下层溶液加入4mL去离子水，1mL 1mol/L盐酸溶液，振荡1min，再加入0.5mL对羧基苯甲醛，振荡1min；取出后加入0.5mol/L磷酸氢二钠溶液1mL，用1mol/L氢氧化钠溶液调节PH至7.5左右，振荡1min，加入5mL乙酸乙酯，振荡1min，5000rpm离心10min；移取上层乙酸乙酯层溶液于另一离心管中，水相再用5mL乙酸乙酯重复萃取两次，合并后氮气吹干；加入1ml正己烷，加盖振荡1min，然后加入0.5mL PBST缓冲液，振荡1min，5000rpm离心10min；吸取下层水相溶液用于分析；

(2)用胶体金层析试纸条检测

从包装中取出所述检测呋喃唑酮代谢物的胶体金免疫层析试纸条，将样品端插入待测样品液中，插入深度不超过标记线，约10-20秒钟取出检测试纸条，水平放置，3-5分钟观察判定检测结果，10分钟以后结果无效。

(3)结果判定

如图5所示，a为阳性，包被膜上对应的质控区C位置显示一条棕红色线，检测区T位置不显示棕红色线，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有AOZ；b为阴性，在包被膜上T、C位置显示有两天棕红色线，表示结果为阴性，说明在待测样品中不含AOZ；c、d为失效，当质控区C不显示出棕红色条带，则无论检测区T显示出棕红色条带与否该试纸均判为无效。

实施例六 本发明所述呋喃唑酮代谢物胶体金层析试纸条性能检测

1、灵敏度

将1mg/mL呋喃唑酮代谢物衍生物(1mg CPAOZ溶于1mL甲醇)用PBS分别稀释为0、1、2、3、4、5、10μg/L的一系列标准溶液，再分别取90μL上述标准溶液滴在试纸条的样品垫上，3min后观察试纸条的显色情况。

当CPAOZ添加浓度为3μg/L时，T线相对于0μg/L时的T线的颜色变浅，而当CPAOZ的添加浓度为4μg/L时，T线消线，说明胶体金试纸条的检测限为4μg/L。

2、特异性

选取4种硝基呋喃代谢物衍生化试剂(CPAOZ、CPAHD、CPSEM、CPAMOZ)测试，观察试纸条显色效果。

将CPAOZ、CPAHD、CPSEM、CPAMOZ母液分别用0.01mol/L、PH7.4的PBS稀释至50μg/L，滴加到试纸条的样品孔，检测结果显示，制备的呋喃唑酮代谢物胶体金试纸条与其他几种硝基呋喃类代谢物衍生化试剂不存在交叉反应。

3、准确性

随机选取8份水产样品，作为供试试样。每份样品分别用HPLC法和本研究制备的CPAOZ胶体金检测试纸条进行检测，比较检测结果。

8份水产样品经高效液相色谱检测，其中6份样品未检出呋喃唑酮代谢物残留，3号样品检测出AOZ含量1.73μg/kg，7号样品检测出AOZ含量2.35μg/kg。这些样品同时用呋喃唑酮代谢物胶体金试纸条检测，结果与HPLC法完全符合，见表1。

表1呋喃唑酮代谢物胶体金试纸条与高效液相色谱法检测结果比较

注：“+”表示阳性，“—”表示阴性。

上述实施例只为说明本发明的技术构思和优点，本发明也可以具有其它的形式变化，如本领域技术人员所熟知，上述实施例仅仅起到对上述发明保护范围内的示范作用，对本领域普通技术人员来说，在本发明所限定的保护范围内还有很多常规变形和其它实施例，这些变形和实施例都将在本发明待批的保护范围之内。