一种检测呋喃唑酮代谢物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法与应用与流程

文档序号:12174288阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种检测呋喃唑酮代谢物的胶体金免疫层析试纸条,其特征在于,该检测试纸条由底板、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫组成,试纸两端设有保护膜;所述样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫依次粘贴于底板上;其中胶体金垫为吸附有胶体金标记的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体,包被膜上含有用呋喃唑酮代谢物偶联载体蛋白的预包被检测线T线,用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液预包被的质控线C线,两条线竖直平行排列。

2.根据权利要求1所述的胶体金层析试纸条,其特征在于,所述底板为PVC条或其它不吸水的硬质材料;所述样品垫和胶体金垫由玻璃纤维棉制成;所述吸水垫由吸水滤纸制成;所述包被膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜;所述保护膜为不透明的胶膜。

3.根据权利要求1所述的胶体金层析试纸条,其特征在于,所述呋喃唑酮代谢物单克隆抗体为鼠源单克隆抗体,由CCTCC NO:C2016140的杂交瘤细胞株AOZ-4G3产生;该杂交瘤细胞株被命名为杂交瘤细胞株AOZ-4G3,于2016年7月31日送交中国典型培养物保藏中心保藏,保藏号为CCTCC NO:C2016140。

4.根据权利要求1所述的胶体金层析试纸条,其特征在于,所述呋喃唑酮代谢物单克隆抗体由呋喃唑酮代谢物抗原产生,该呋喃唑酮代谢物抗原为由呋喃唑酮代谢物与载体蛋白采用碳化二亚胺法合成的偶联物,包括免疫原与检测原;所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清白蛋白、免疫血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。

5.根据权利要求4所述的胶体金层析试纸条,其特征在于,所述呋喃唑酮代谢物免疫原使用牛血清白蛋白为载体;所述呋喃唑酮代谢物检测原使用卵清蛋白为载体。

6.制备如权利要求1所述检测呋喃唑酮代谢物的胶体金免疫层析试纸条的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:

(1)制备呋喃唑酮代谢物抗原工作液:

(a)呋喃唑酮代谢物衍生化:取0.25g AOZ,用2mL左右的甲醇于室温下搅拌使之溶解;取0.15g 3-羧基苯甲醛,用2mL甲醇使之溶解,在搅拌下缓慢滴入上述AOZ溶液中,室温下搅拌反应5h,过滤,烘干滤渣即得呋喃唑酮代谢物的衍生物CPAOZ;

(b)免疫原的合成:称取50mg的牛血清白蛋白BSA溶于pH值7.4的1mL 0.1mol/L的PBS中,加入N,N-二甲基酰胺DMF 1mL,搅拌溶解;再将步骤(a)所得的CPAOZ 8mg溶于1mLDMF溶液中,搅拌下加入二环己基亚胺DCC 14mg和N-羟基琥珀酰亚胺NHS 6mg,4℃下密封搅拌过夜,8000r/min离心15分钟,收集上清液装入透析袋中,4℃条件下用pH值7.4的0.01mol/L PBS透析3d,每天换液3-4次,得CPAOZ-BSA溶液;

(c)检测原的合成:称取40mg的卵清蛋白OVA溶于pH值7.4的1mL 0.1mol/L PBS中,加入N,N-二甲基酰胺DMF 1mL,搅拌溶解;再将步骤(a)所得的CPAOZ 8mg溶于1mLDMF溶液中,搅拌下加入二环己基亚胺DCC 14mg和N-羟基琥珀酰亚胺NHS 6mg,4℃下密封搅拌过夜,8000r/min离心15分钟,收集上清液装入透析袋中,4℃条件下用pH值7.4的0.01mol/LPBS透析3d,每天换液3-4次,得CPAOZ-OVA溶液;

(2)制备呋喃唑酮代谢物单克隆抗体工作液:

(a)动物免疫:选择载体蛋白为牛血清白蛋白的免疫原,免疫6-8周龄的雌性Blab/c小鼠,间隔2周免疫1次,三次免疫后断尾取血测定效价和抑制率,选择结果最佳的小鼠准备融合;

(b)细胞融合:取步骤(a)选定的小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/O细胞进行融合,间接ELISA法测定上清液选取阳性高的孔,通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆,直至建立产生单一抗呋喃唑酮代谢物的单克隆抗体的杂交瘤细胞株;

(c)单克隆抗体的大量制备:选取个体较大的雌性Blab/c小鼠,采用体内诱生腹水法,大量制备腹水,并通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水,分成小管,-20℃保存,得呋喃唑酮代谢物单克隆抗体;

(3)制备胶体金标记的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体:

将待标记的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体溶液10000r/min离心30min,取胶体金溶液10mL,用0.1mol/L K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2;取等量呋喃唑酮代谢物单克隆抗体溶液,磁力搅拌下与胶体金溶液混合,室温孵育15min,10000r/min离心30min,弃上清,将所得沉淀用每升含10g BSA、0.5g叠氮钠、浓度为0.02mol/L的Na2B4O7溶液稀释,即获得胶体金标记的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体,4℃保存备用;

(4)胶体金垫制备:按规格裁取玻璃纤维棉,将胶体金标记的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体用喷金仪均匀喷洒于玻璃纤维棉上,37℃干燥1h,密封,4℃保存备用;

(5)检测线和质控线的制备:将呋喃唑酮代谢物抗原放于喷金仪贮存池A,羊抗小鼠IgG溶液放于贮存池B,开机分别点射于膜中央,形成间距0.5cm的直线式隐形检测线和隐形质控线,自然干燥,密封,4℃保存备用;

(6)试纸条组装:将样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫按顺序依次粘贴于底板上,并在试纸条两端的表面粘贴保护膜,在切槽机上切割成试纸条。

7.如权利要求1所述的胶体金层析试纸条在用于检测动物组织、尿液和牛奶中呋喃唑酮代谢物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,包括如下步骤:

(1)样品前处理

(a)肉类、肝脏或水产品样品组织的前处理

组织匀浆后,称取2g于50ml离心管中,加入4mL去离子水,1mL 1mol/L盐酸溶液,振荡1min,再加入0.5mL对羧基苯甲醛,振荡1min;取出后加入0.5mol/L磷酸氢二钠溶液1mL,用1mol/L氢氧化钠溶液调节PH至7.5左右,振荡1min,加入5mL乙酸乙酯,振荡1min,5000rpm离心10min;移取上层乙酸乙酯层溶液于另一离心管中,水相再用5mL乙酸乙酯重复萃取两次,合并后氮气吹干;加入1ml正己烷,加盖振荡1min,然后加入0.5mL PBST缓冲液,振荡1min,5000rpm离心10min;吸取下层水相溶液用于分析;

(b)尿样前处理

将尿样5000rpm离心5min至清亮,取上清50ul进行检测;

(c)奶样前处理

取奶样2mL室温条件下5000rpm离心10min,取下层溶液加入4mL去离子水,1mL 1mol/L盐酸溶液,振荡1min,再加入0.5mL对羧基苯甲醛,振荡1min;取出后加入0.5mol/L磷酸氢二钠溶液1mL,用1mol/L氢氧化钠溶液调节PH至7.5左右,振荡1min,加入5mL乙酸乙酯,振荡1min,5000rpm离心10min;移取上层乙酸乙酯层溶液于另一离心管中,水相再用5mL乙酸乙酯重复萃取两次,合并后氮气吹干;加入1ml正己烷,加盖振荡1min,然后加入0.5mL PBST缓冲液,振荡1min,5000rpm离心10min;吸取下层水相溶液用于分析;

(2)用胶体金层析试纸条检测

从包装中取出所述检测呋喃唑酮代谢物的胶体金免疫层析试纸条,将样品端插入待测样品液中,插入深度不超过标记线,约10-20秒钟取出检测试纸条,水平放置,3-5分钟观察判定检测结果,10分钟以后结果无效;

(3)结果判定

(a)阳性:如果包被膜上对应的质控区C位置显示一条棕红色线,检测区T位置不显示棕红色线,表示检测结果为阳性,说明在待测样品中含有AOZ;

(b)阴性:如果在包被膜上T、C位置显示有两天棕红色线,表示结果为阴性,说明在待测样品中不含AOZ;

(c)失效:当质控区C不显示出棕红色条带,则无论检测区T显示出棕红色条带与否该试纸均判为无效。

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