检测CRP、SAA的免疫层析试剂盒及制备和使用方法与流程

本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及一种检测CRP、SAA的免疫层析试剂盒及制备和使用方法。

背景技术：

C-反应蛋白：CRP(C-Reactive protein)当人体受了微生物等多种因子侵袭后，肝脏在几小时内产生一种急性期反应蛋白，常规CRP在感染发生后6—8h即开始升高，24—48h达到高峰，高峰值可达正常的数百倍，在感染消除后其含量急骤下降，一周内可恢复正常。这为疾病早期感染类型的鉴别提供了重要的依据。常规CRP检测主要用于感染性疾病的实验检查依据。

常规CRP对于感染的诊断和鉴别已经在临床上得到广泛的应用，目前对于CRP与其他指标的联合应用也日益受到重视。

血清淀粉样蛋白A(serμm amyloid A,SAA)是组织淀粉样蛋白A的前体物质，属于急性时相反应蛋白。SAA是血液中以低水平存在的正常组份。当人体有病毒或细菌感染性炎症、活动性病变、组织大面积损伤时很快升高。特别是在病毒急性感染时(48～72h)可迅速升高，并在疾病的恢复期迅速下降。因此SAA是感染机体病毒时极有效的辅助诊断指标。

联合检测的临床有用性SAA是感染性疾病辅助诊断的新试验。SAA、CRP的组合检测更能体现优势互补，对细菌和病毒感染的诊断和鉴别诊断又多了一份依据，更能体现单项指标不能反映的临床增值意义。组合检测的特点和临床意义简述如下：细菌和病毒感染鉴别诊断的意义：SAA在细菌和病毒感染的早期均可升高，而CRP对病毒感染时一般不增高的特点，因此两者同时检测可对早期细菌和病毒感染的鉴别诊断提供有力的数据。例如两者均增高细菌感染的趋向性较大；而CRP正常SAA明显增高者,结合临床对病毒性感染的趋向性诊断又多了一份依据。特别是在婴幼儿感染性疾病的早期，细菌和病毒感染确是很难鉴别，而SAA和CRP的联合检测比单独测CRP更有独特的意义。

目前市场上没有已获得注册证的能同时检测CRP和SAA浓度的试剂盒，临床上目前有单独检测CRP和SAA的试剂盒，如果需要同时检测两者的结果，需要检验科进行两次操作，而且根据试剂盒所需的标本类型不同，患者还可能需要重复取样，不仅增加了试剂，耗材的浪费，增加了检测治疗的成本，还给患者造成了额外的负担。

通过对现有专利文献的检索发现，天津中新科炬生物制药有限公司的中国发明专利申请《一种同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置》、申请号：201511030398.4提供一种同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置，由互相独立的人血清淀粉样蛋白A(SAA)，人降钙素原(PCT)和C-反应蛋白(CRP)检测试纸，三联卡壳和附带了相应判断方法和标准曲线的免疫层析判读结果记录仪组成的一种同时快速定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置。但该方法为三联卡壳，需要分别加样3次，而且加样的量及方法也不一样，并不能降低试剂及耗材的成本，不能实现真正意义上的联检。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种基于纳米金的检测CRP、SAA的免疫层析试剂盒及制备和使用方法。该试剂盒提供了一种能同时检测CRP和SAA浓度的纳米金免疫侧向层析试纸条，该试纸条用CRP，SAA单克隆抗体作为反应线，用兔IgG作为质控线。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种同时定量检测CRP、SAA的纳米胶体金免疫层析试剂盒，包括免疫层析检测试剂板、纳米胶体金应用溶液和血液采样装置，所述免疫层析检测试剂板包含设有抗CRP包被线、抗SAA包被线和兔抗质控包被线的硝酸纤维素膜；所述纳米胶体金应用溶液包含缀合配对SAA抗体的抗SAA纳米胶体金金贮、缀合配对CRP抗体的抗CRP纳米胶体金金贮、缀合羊抗兔纳米胶体金金贮以及稳定缓冲液。

优选的，所述试剂盒的检测基础是固相双抗体夹心的免疫反应。

优选的，所述血液采样装置为吸管或血液定量采集、转移和稀释的一体化装置。所述血液定量采集、转移和稀释的一体化装置记载在申请号201120045729.2的在先实用新型专利。

优选的，所述纳米胶体金应用溶液为包含终浓度0.5-2μg/mL羊抗兔抗体的金贮、终浓度0.5-2μg/mL抗SAA抗体的金贮、终浓度0.5-2μg/mL抗CRP抗体的金贮、终浓度1-3μg/mL的CRP游离抗体，5-10mg/mLBSA或Casein、1-10mg/mL表面活性剂的硼酸盐缓冲液。

优选的，所述抗体是指单克隆或多克隆抗体优选的。

所述金贮(纳米胶体金金贮)是指纳米胶体金与识别目标蛋白特定位点的抗体静电结合形成的复合物。

优选的，所述纳米胶体金的粒径范围为15-50nm。

第二方面，本发明还涉及一种前述的同时定量检测CRP、SAA的纳米胶体金免疫层析试剂盒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

S1、免疫层析检测试剂板的制备：在底板中间粘贴硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜的一端贴上样品垫，另一端贴上吸水垫，在硝酸纤维素膜中间靠近样品垫的一侧起依次喷上抗CRP包被线、抗SAA包被线和兔抗质控包被线，切条，安装到卡壳；

S2、纳米胶体金应用溶液的制备：在硼酸盐缓冲液中加入终浓度0.5-2μg/mL羊抗兔抗体的金贮、终浓度0.5-2μg/mL抗SAA抗体的金贮、终浓度0.5-2μg/mL抗CRP抗体的金贮、终浓度1-3μg/mL的CRP游离抗体，5-10mg/mLBSA或Casein、终浓度1-10mg/mL表面活性剂制备得到纳米胶体金应用溶液。

所述表面活性剂优选Trition-100。

优选的，步骤S1中，硝酸纤维素膜上分别以0.8-1μl/cm的喷量依次喷涂抗CRP单克隆抗体溶液、抗SAA单克隆抗体溶液、兔抗体溶液形成抗CRP包被线、抗SAA包被线和兔抗质控包被线。

优选的，用柠檬酸缓冲液分别稀释抗SAA单克隆抗体，抗CRP单克隆抗体，兔抗体配制得到所述抗SAA单克隆抗体溶液、抗CRP单克隆抗体溶液和兔抗体溶液。

优选的，步骤S1中，将抗SAA单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、兔抗体分别用pH为5.2-5.5的0.05-1.5M柠檬酸冲液稀释成0.5-2.0mg/ml，同时添加终浓度10-20/mL的蔗糖和终浓度0.1-0.5/mLSDS，即可分别配制得到抗SAA单克隆抗体溶液、抗CRP单克隆抗体溶液和兔抗体溶液。

优选的，步骤S2中，所述硼酸盐缓冲液为含5-10mg/mLNaCl、1.5-2mg/mL叠氮钠的0.01-0.1M硼酸-硼砂缓冲液。

优选的，步骤S2中，按1-10μl/mL的浓度在纳米胶体金中加入K₂CO₃调节pH，加入羊抗兔抗体、抗SAA抗体或抗CRP抗体，混匀，包被浓度为0.005-0.02mg/mL；离心洗涤后用磷酸盐缓冲液重悬，即分别制得羊抗兔抗体的金贮(也称羊抗兔纳米胶体金金贮)、抗SAA抗体的金贮(也称抗SAA纳米胶体金金贮)、抗CRP抗体的金贮(也称抗CRP纳米胶体金金贮)。

优选的，所述混匀后、离心洗涤前还包括如下步骤：加入10mg/mL的Carbowax溶液，使其终浓度为0.2-0.25mg/mL。

第三方面，本发明还涉及一种前述的同时定量检测CRP、SAA的纳米胶体金免疫层析试剂盒的使用方法，所述方法包括如下步骤：

A1、测定校准品，每个浓度重复10次，每个检测中加入校准品3μL，与1mL纳米胶体金应用溶液混合后滴加到试剂板样品垫上的加样孔中，在免疫层析定量分析仪上进行反射率的分析，获得SAA标准曲线和CRP标准曲线；

A2、样本测试，每个检测中加入样品3μL，与1mL纳米胶体金应用溶液混合后滴加到试剂板样品垫上的加样孔中，在免疫层析定量分析仪进行反射率的分析，将测试结果分别带入所述SAA标准曲线和CRP标准曲线，计算获得样本中的SAA浓度和CRP浓度。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供的基于纳米金的快速定量同时检测CRP和SAA浓度的免疫层析试剂盒，能够一次取样，一次获取两个指标的结果，简单快速，且精密度在10％以内，与公认方法的相关性良好。

2、本发明的方法将待测样品中的抗原抗体反应信息转化成了另一种更为直观的反射率信号，利用该方法，经过一系列的研究工作，可以获得反射率信号与待测抗原之间的对应关系，进而制作标准曲线，再通过对反射率信号与标准曲线的比对最终获得待测抗原的定量或者定性检测结果。

3、常用的免疫层析法，通常将纳米胶体金溶液喷洒或浸渍于固相载体上，后通过加热或真空使其附着于固相载体上。此种方法由于纳米金的释放的差异，各部分材料的接触的差异往往会引起较大的CV以及一些死金现象，而本方法经过改良后使用了液相的金直接与样本稀释液混合，提高了反应的效率，避免了释放引起的问题，降低了产品的整体CV，同时通过优化纳米金稀释液体系，解决了液相纳米胶体金的稳定性问题，最终成功的制备得到同时定量检测CRP、SAA的纳米胶体金免疫层析试剂盒。

附图说明

图1为本发明试剂盒的结构示意图；

图2为SAA标准曲线；

图3为CRP标准曲线；

图4为SAA线性预测图；

图5为CRP线性预测图；

其中，1为纳米胶体金应用溶液、2为塑料底板、3为样品垫、4为吸水垫、5为硝酸纤维素膜、6为抗CRP包被线、7为抗SAA包被线、8为兔抗质控包被线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例一种快速定量检测CRP+SAA的纳米胶体金免疫层析试剂盒。该试剂盒的检测基础是固相双抗体夹心的免疫反应：如图1所示，检测试剂盒包含以下几个组分：免疫层析检测试剂板、纳米胶体金应用溶液1和.血液采样装置(可选用吸管或血液定量采集、转移和稀释的一体化装置)。

所述的免疫层析检测试剂板由硝酸纤维素膜5，样品垫3，吸水垫4，塑料底板2及塑料卡壳组成；所述硝酸纤维素膜5上依次喷涂抗CRP单克隆抗体溶液、抗SAA单克隆抗体溶液、兔抗体溶液形成抗CRP包被线6、抗SAA包被线7和兔抗质控包被线8。

所述的纳米胶体金应用液由配对SAA抗体的纳米胶体金金贮，配对CRP抗体的纳米胶体金金贮，羊抗兔抗体的纳米胶体金金贮及稳定缓冲液组成。该纳米胶体金金贮是指纳米胶体金与识别目标蛋白特定位点的抗体静电结合形成的复合物。该抗体是指单克隆或多克隆抗体。

本实施例的纳米胶体金层析免疫试剂盒的制备方法包括如下步骤：

1、检测试剂板的制备

1)空白大卡的制备

将硝酸纤维素膜裁成30±1cm的长度粘贴在塑料底板的中间。

2)质控线的制备

将兔IgG用0.07M的柠檬酸冲液(pH5.2-5.5)稀释成1.0mg/ml，同时添加终浓度10-20mg/mL的蔗糖和终浓度0.1-0.5mg/mLSDS。

3)检测线的制备

a、SAA检测线的制备

将抗SAA单克隆抗体用0.07M的柠檬酸冲液(pH5.2-5.5)稀释成1.0mg/ml，同时添加终浓度10-20mg/mL的蔗糖和终浓度0.1-0.5mg/mL SDS。

b、CRP检测线的制备

将抗CRP单克隆抗体用0.07M的柠檬酸冲液(pH5.2-5.5)稀释成1.0mg/ml，同时添加终浓度10-20mg/mL的蔗糖和终浓度0.1-0.5/mLSDS。

4)喷膜

将贴好硝酸纤维素膜的空白大卡放置在Bio-Dot三维喷膜仪上，三条线的喷量设置均为0.8-1μl/cm(更优选为0.8μl/cm)，依次喷上抗CRP包被线、抗SAA包被线和质控包被线。

5)干燥

喷好的大卡放入37±2℃的烘箱中烘干15min，烘干后封入铝箔袋，装入干燥剂，密封继续在37±2℃的烘箱放置42-72小时。

6)粘贴

在烘干好的大卡上靠近抗CRP包被线一端粘贴上样品垫，在靠近质控包被线一端粘帖上吸水垫。

7)切条组装

将粘贴好的试剂大卡切条，安装到塑料卡壳的下盖中，盖上上盖，用压盖机压合好。

2、纳米胶体金应用液的制备

1)纳米胶体金溶液的制备

量取2500mL超纯水放入5000mL三角烧瓶内，与适量玻璃珠共同加入至沸，在沸腾状态下加入45mL±5mL1％柠檬酸三钠溶液(加入量随小试确定)，待重新沸腾(约30秒)后再加入25mL±1mL 1％氯化金溶液，2分钟后将加热器调节至微沸，从加入氯化金溶液开始计时，共煮沸15分钟，冷却至室温，液体呈澄清透明酒红色。取3ml纳米金溶液，于波长520nm处测取吸光度值，应在0.95-1.15之间；在粒度分析仪中测试其粒径值，应在15-50nm之间。

2)羊抗兔IgG纳米胶体金金贮的制备

按1-10μl/mL(更优选5-8μl/mL)的浓度在纳米胶体金中加入0.1M K₂CO₃调节PH，摇匀，加入羊抗兔多克隆抗体，包被浓度为0.005-0.02mg/mL(更优选为0.005-0.01mg/mL)，混匀10分钟，加入前一次一半量的0.1M K₂CO₃混匀5分钟，加入10mg/mL的Carbowax溶液，使其终浓度为0.2-0.25mg/mL以保护纳米胶体金。在8℃，23800×g下离心20分钟，吸去上清，沉淀用等量的10mg/mLCarbowax，PH7.4-7.6的溶液重悬清洗，再次在8℃，23800×g下离心20分钟，吸去上清。沉淀用含10-70mg/mL蔗糖，1-5mg/mL Cabowax，10-50mg/mL BSA和0.5-1mg/mL叠氮钠的0.025-0.1M的磷酸缓冲液，PH 7.4，重悬至原体积的1/10。

3)抗SAA纳米胶体金金贮的制备

按1-10μl/mL(更优选5-8μl/mL)的浓度在纳米胶体金中加入0.1M K₂CO₃调节PH，摇匀，加入抗SAA单克隆抗体，包被浓度为0.005-0.02mg/mL(更优选为0.005-0.01mg/mL)，混匀10分钟，加入前一次一半量的0.1M K₂CO₃混匀5分钟，加入10mg/mL的Carbowax溶液，使其终浓度为0.2-0.25mg/mL以保护纳米胶体金。在8℃，23800×g下离心20分钟，吸去上清，沉淀用等量的10mg/mLCarbowax，PH7.4-7.6的清洗液重悬清洗，再次在8℃，23800×g下离心20分钟，吸去上清。沉淀用含10-70mg/mL蔗糖，1-5mg/mLCabowax，10-50mg/mLBSA和0.5-1mg/mL叠氮钠的0.025-0.1M的磷酸缓冲液，PH 7.4，重悬至原体积的1/10.

4)抗CRP纳米胶体金金贮的制备

按1-10μl/mL(更优选5-8μl/mL)的浓度在纳米胶体金中加入0.1M K₂CO₃调节PH，摇匀，加入抗CRP单克隆抗体，包被浓度为0.005-0.01mg/mL，混匀10分钟，加入前一次一半量的0.1M K₂CO₃混匀5分钟，加入10mg/mL的Carbowax溶液，使其终浓度为0.2-0.25mg/mL以保护纳米胶体金。在8℃，23800×g下离心20分钟，吸去上清，沉淀用等量的10mg/mLCarbowax，PH7.4-7.6的清洗液重悬清洗，再次在8℃，23800×g下离心20分钟，吸去上清。沉淀用含10-70mg/mL蔗糖，1-5mg/mLCabowax，10-50mg/mLBSA和0.5-1mg/mL叠氮钠0.025-0.1M的磷酸缓冲液，PH 7.4，重悬至原体积的1/10.

5)纳米胶体金应用液的制备

在0.001-0.1M硼酸-硼砂缓冲液，其中含5-10mg/mLBSA或Casein、5-10mg/mLNaCl、1-10mg/mLTrition-100、1.5-2mg/mL叠氮钠，加入终浓度0.5-2μg/mL羊抗兔抗体的金贮、终浓度0.5-2μg/mL抗SAA抗体的金贮、终浓度0.5-2μg/mL抗CRP抗体的金贮、终浓度1-3μg/mL的CRP游离抗体。

3、CRP+SAA检测

1)标准曲线制备

采用上述方法制备的试剂组合成CRP+SAA纳米胶体金定量检测试剂盒，测定校准品，每个浓度重复10次。

每个检测中加入校准品3μL，与1mL纳米胶体金应用液混合，然后滴加到试剂板加样孔中，5分钟后在配套的读数仪上进行读数，标准曲线数据如表1、表2所示，标准曲线如图2、图3所示。

由图2、图3的标准曲线可以看到，该标准曲线线性良好，可以通过该标准曲线对样本中所含的SAA和CRP浓度进行定量分析。

通过表1结果可知，检测试剂盒的批内精密度良好，校准品各浓度点号精密度均小于10％，且试剂灵敏度良好，SAA 2.5mg/L水平与0值校准品,CRP 0.5mg/L与0值校准品有显著区分。

表1 SAA定量检测标准曲线数据

表2 CRP定量检测标准曲线数据

2)样本测试

每个检测中加入样品3μL，与1mL纳米胶体金应用液混合，然后滴加到试剂板加样孔中，5分钟后在配套的读数仪上进行读数，将测试结果带入图2、图3的标准曲线，计算样品测试浓度，比对数据如表3、表4所示，与西门子测试结果进行相关性分析，相关性曲线如图4、图5所示。

西门子系统和配套的CRP和SAA试剂盒是知名的检测试剂盒，其精度和结果公认可靠。由图4、图5显示可知本发明的试剂盒测定结果与西门子仪器及配套试剂盒测定结果相关系数R²为0.98216和0.98495，相关性较好，可用于临床诊断使用。

表3 SAA临床样本比对结果。

表4 CRP临床样本比对结果