同时检测克伦特罗和莱克多巴胺的AlphaLISA检测试剂盒的制作方法

本发明涉及动物源性肌肉组织中克伦特罗和莱克多巴胺的检测，具体涉及动物源性肌肉组织中同时检测克伦特罗和莱克多巴胺的AlphaLISA检测试剂盒。

背景技术：

克伦特罗和莱克多巴胺是具有相似的化学结构和功能的β-受体激动剂。克伦特罗和莱克多巴胺可以用于治疗疾病以及作为生长促进剂和育肥剂减少脂肪含量，增加肌肉蛋白质的合成。然而，他们会对人体产生严重的影响，如心悸、头痛等。现有的检测克伦特罗和莱克多巴胺的方法有免疫吸附试验，电化学检测法，荧光探针法，高效液相色谱法(HPLC)，超痕量LC-MS/MS，气相色谱-质谱（GC-MS）等。这些方法是非常可靠重要的。然而，这些方法都有着诸如操作繁琐，检测灵敏度不高，仪器成本高等缺点。为了确保食品安全，有必要建立一种快速有效的方法来检测和筛选克伦特罗和莱克多巴胺。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明通过AlphaLISA检测方法来同时检测动物源性肌肉组织中克伦特罗和莱克多巴胺，提供了一种用于检测动物源性肌肉组织中克伦特罗和莱克多巴胺的AlphaLISA检测试剂盒。

本发明采用的技术方案是：动物源性肌肉组织中同时检测克伦特罗和莱克多巴胺的AlphaLISA检测试剂盒，包括克伦特罗标准品、莱克多巴胺标准品、生物素化克伦特罗、生物素化莱克多巴胺、抗克伦特罗单克隆抗体、抗莱克多巴胺单克隆抗体、链亲和素供体微珠、抗鼠IgG包被受体微珠、检测缓冲液、白色反应板和封口膜；其中链亲和素供体微珠包括100μg/ml 供体微珠，抗鼠IgG包被受体微珠包括100μg/ml 受体微珠。

所述抗克伦特罗单克隆抗体浓度为3 mg/mL，生物素化克伦特罗浓度为2.5 mg/mL，抗莱克多巴胺单克隆抗体浓度为3 mg/mL，生物素化莱克多巴胺浓度为2.5 mg/mL，抗鼠IgG包被受体微珠浓度为0.18 mg/mL，链亲和素供体微珠浓度为0.18 mg/mL，使用时，以总体积25μL计：其中抗鼠IgG包被受体微珠5μL、链亲和素供体微珠5μL、生物素化克伦特罗和生物素化莱克多巴胺混合溶液（1：1，V/V）5μL、抗克伦特罗单克隆抗体和抗莱克多巴胺单克隆抗体混合溶液（1：1，V/V）5μL、待测样品5μL。

所述生物素化克伦特罗和生物素化莱克多巴胺由以下方法制备，取克伦特罗32 μL和生物素2 μL、莱克多巴胺各32 μL和生物素2 μL分别添加到250 μL离心管中，然后通过涡旋振荡器混合，并避光孵育90分钟，4℃冰箱存储。

本发明的试剂盒封装时，包括克伦特罗标准品（10 mg，10 mg/盒）、莱克多巴胺标准品（10 mg，10 mg/盒）、生物素化克伦特罗抗原（2.5 mg/mL，100 μL/盒）、生物素化莱克多巴胺抗原（2.5 mg/mL，100 μL/盒）、抗克伦特罗单克隆抗体（3 mg/mL，100 μL/盒）、抗莱克多巴胺单克隆抗体（3 mg/mL，100 μL/盒）、抗鼠IgG包被受体微珠（1 mg/mL，50 μL/盒）、链亲和素供体微珠（1 mg/mL，50 μL/盒）、检测缓冲液（100 mL/盒）、白色反应板（96T，1块/盒）、封口膜（1块/盒）、操作说明书（1份/盒）。

借由上述技术方案，本发明至少有一下优点和有益效果：利用本发明同时检测检测动物源性肌肉组织中克伦特罗和莱克多巴胺，具有样品用量少仅使用5μL即可、简短快速、灵敏度高、不需洗涤等优点。

附图说明

图1为抗原不同浓度对荧光强度的影响；

图2为抗体不同浓度对荧光强度的影响；

图3为混合抗体浓度1:600时，克伦特罗、莱克多巴胺标准曲线；

图4为供体微珠和受体微珠浓度优化结果图；

图5为时间和温度条件优化结果图；

图6为克伦特罗和莱克多巴胺混合标准曲线；

图7为克伦特罗、莱克多巴胺标准曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

试剂盒中的抗克伦特罗单克隆抗体和抗莱克多巴胺单克隆抗体可选用市购的，也可用常规制备单克隆抗体的方法制备。

1 生物素化抗原的制备

生物素化抗原的制备过程如下：取克伦特罗抗原、莱克多巴胺抗原各32 μL分别与2 μL生物素分别添加到250 μL离心管中，然后通过涡旋振荡器混合，并避光孵育90分钟，在4℃冰箱存储后。得到生物素化的抗原。

2 反应条件摸索

2.1混合抗原-抗体的优化

考察混合抗原-抗体浓度对荧光强度的影响。抗原与抗体浓度的变化，从1:100～1:19200 。荧光强度逐渐增强抗原稀释倍数的增加，直到达到最大抗原浓度1:9600（图1）。在混合抗原的浓度为1:9600时，对两种抗体浓度进行了优化（图2）。显示当浓度为1:300 ～1:1200时荧光值达到最大。在混合抗体浓度为1:300 ～1:1200时测定克伦特罗（CL）和莱克多巴胺（RAC）（1:1）的IC50值。结果如图2所示。当混合抗体浓度进一步降低到1:600，竞争抑制效应和混合抗体的分析灵敏度是一致的。

2.2 供体和受体珠的优化

供体和受体微珠浓度影响如图4所示。两种微珠的浓度用缓冲液稀释至0.01mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL，0.09mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL，0.18mg/mL和0.21mg/mL。最大荧光强度是在供体珠浓度在0.18 mg/mL。在供体微珠0.18 mg/mL，受体微珠浓度0.18mg/mL和0.21mg/mL条件下测定IC50。 CL和RAC的IC50分别为2.89 ng/mL2.69 ng/mL（受体微珠0.18mg/mL），CL和RAC的IC50分别为2.75ng/mL 4.15ng/mL（受体微珠0.21mg/mL）。受体珠0.18 mg/mL，供体微珠浓度0.18 mg/mL时这两种化合物的IC50较为接近。供体和受体微珠的浓度在0.18mg/mL选为最佳条件。

2.3 时间和温度的优化

反应温度和时间也是很关键的因素，因为他们可以影响免疫反应的结合动力学。图5显示了不同温度和时间的影响。选择25℃在和37℃的条件下反应温度的最佳条件，反应时间分别为30、45、60和90 min，在同一温度下，反应值随着反应时间的延长而增加，同时，在37℃的反应值明显高于在25℃。在37℃条件下，反应时间为60min和90 min，建立了曲线。反应时间60 min时，CL和RAC的IC50分别为2.79ng/mL 3.09ng/mL，反应时间60 min时，IC50分别为3.24ng/mL和3.75ng/mL。反应时间60 min时，反应时间少于90min，IC50值小于90min时的IC50值。因此，反应温度37℃和反应时间为60 min时选择进一步的实验条件。以此节省时间和提高检测灵敏度。总反应时间约为90min。

2.4 线性

不同浓度的标准溶液CL，RAC和混合标准溶液（CL：RAC，1:1）在最佳优化条件下进行测试。在0.1-50 ng/ml的浓度范围（0.1，1，5，10，20和50 ng/ml）建立标准曲线（图6和图7）。混合标准方法的IC50为3.58 ng/ml；线性回归方程为y =－0.32719x + 0.76277，相关系数R = 0.99519（图6）。检测限（LOD）为0.02 ng/mL，CL和RAC的线性回归方程分别为y =－0.23998x + 0.88908，y =－0.22266x + 0.81529（图7），IC50分别为2.57 ng/mL和2.96 ng/mL，说明该方法具有良好的分析性能。

3.4 特异性

将克伦特罗和莱克多巴胺及其相关的9种化合物用1×buffer缓冲溶液分别配置为0.1～100 ng/mL的待测溶液。用已建立的AlphaLISA 方法进行检测，测定 IC 50值。结果所示。克伦特罗和莱克多巴胺不与其他化合物发生交叉反应。

4 动物源性肌肉组织中克伦特罗和莱克多巴胺的AlphaLISA检测方法的初步应用

对市售的猪肉、牛肉样品经过提取后，采用已建立的AlphaLISA 方法进行检测，结果表明，样品中均未检出克伦特罗和莱克多巴胺。并对猪肉样品进行了加标回收试验，加标水平分别为5 μg/kg、10 μg/kg 、20 μg/kg 3 个浓度水平，每个浓度重复检测 3 次。AlphaLISA测定CL回收率为86.6%～98.3%，RSD为6.8%～9.9%，RAC回收率 84.2%～103.2%， RSD为4.5%～10.4%；混合体系CL + RAC（1:1）回收率在88.8%～102.8%之间，RSD为5.1%～11.2%。