本发明属于生物检测领域，具体涉及He4a临床免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：卵巢癌在女性生殖系统恶性肿瘤中发病率为第三位，仅次于子宫颈癌和子宫体癌，但死亡率却居首位，因卵巢位于盆腔深部不易扪及，患者出现临床症状就诊时多数已是晚期，其五年生存率徘徊于25-30％之间。而早期卵巢癌患者5年生存率可达90％，因此，提高卵巢癌的早期诊断水平对于早期治疗、延长患者生存期具有重要意义。血清肿瘤标志物检测简便且创伤小，因而在肿瘤筛查、诊断、治疗等方面广泛应用。目前CA125是临床上最常用的肿瘤标记物，但由于CA125在生理期和一些盆腔良性病变中也有升高，限制了它的应用。因此，需要一种更加灵敏和特异的肿瘤标记物来提高卵巢癌的早期诊断水平。人附睾蛋白4(HE4/HE4a)基因最初是在人附睾远端上皮细胞中发现的，并认为HE4是WFDC2基因的编码产物，其为弱酸性小分子分泌蛋白，是乳酸蛋白(WAP)结构域家族中的一员。WAP结构域是由近50个氨基酸组成的保守序列和由8个半胱氨酸为特点的4个二硫键核心区组成，其编码产物为具有各种不同功能的小分子分泌性蛋白，分子量为11KDa，远小于CA125，这可能是在卵巢癌早期HE4比CA125更容易分泌进入外周血的主要原因。HE4在正常卵巢组织及良性肿瘤中含量极低，但在卵巢癌中含量较高，因此，血清HE4含量的测定将有助于卵巢癌的早期诊断及治疗效果的监测，联合CA125可提高卵巢癌诊断的敏感度和特异性。传统的化学发光免疫分析大多以微孔板作为固相载体连接抗原或抗体，吖啶酯快速集中的发光特性使免疫分析过程更易实现自动化，便对固相载体有进一步要求。磁性微粒作为更加高效的抗原、抗体免疫反应固相载体，是一种在外磁场存在的条件下具有响应性的磁性金属或金属氧化物，大多以氧化铁为核心，经过分子修饰可以在其表面固定大量生物分子。此外磁性微粒的超顺磁性使其在外加磁场存在的情况下能够迅速聚集，而去掉外磁场后又能够重新悬浮分散于溶液中，极大缩短免疫检测操作过程中的清洗时间。但是采用吖啶酯进行化学发光免疫分析时，存在采用HNO3/H2O2系统激发时发光值小，灵敏度低等缺点，虽然本领域中会采用在NaOH溶液二次激发时添加Triton-100来增加发光强度，但是在实际应用中效果较差，仍然无法解决吖啶酯发光强度弱的缺点。并且抗体包被的磁性微球在长期保存时容易发生聚集，从而影响试剂盒长期保存的稳定性。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种HE4a的定量测定试剂盒，其包含的试剂有包被HE4a抗体的磁分离试剂，吖啶酯标记的HE4a抗体溶液，洗涤液以及化学发光激发溶液。.所述包被HE4a抗体的磁分离试剂为含有0.8mg/ml的偶联有抗HE4a单克隆抗体的磁性微球，0.1mg/ml的丙二醇，0.1mg/ml的PEG200的100mmol/L的PBS缓冲液，pH值为7.4。所述吖啶酯标记的HE4a抗体溶液是含有0.5mg/ml吖啶酯标记的抗HE4a单克隆抗体和0.5mg/ml酪蛋白的100mmol/L的PBS缓冲液，pH值为7.4。洗涤液由在浓度为50mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1％的Tween-20配制而成。所述化学发光激发溶液分为发光激发溶液A和发光激发溶液B；发光激发溶液A为含有0.1MHNO3和1mg/mL的过氧化氢溶液；所述发光激发溶液B为含有5mg/mL的十二烷基二甲基苯基溴化鏻和0.25MNaOH溶液。在进一步地实施方案中，所述吖啶酯选自4-(2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐、吖啶酯-NSP-DMAE-NHS或吖啶磺酰胺NSP-SA-NHS；优选为4-(2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐。本发明的另一个目的是提供所述试剂盒的制备方法，具体步骤如下：1)包被HE4a抗体的磁分离试剂的制备：采用化学交联法将HE4a单克隆抗体和磁性微球偶联，磁性微球直径在1.0μm左右，制备后用PBS缓冲液冲洗三次，然后用70mmol/L的PBS缓冲液重新悬浮，加入终浓度0.1mg/ml的丙二醇和0.1mg/ml的PEG200，调pH值至7.4即得；2)吖啶酯标记的HE4a抗体溶液的制备：向pH值为7.5的100mM的PBS缓冲液中加入0.3g的HE4a单克隆抗体和0.5mM的4-(2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐，避光情况下室温摇晃反应20min，反应完毕后，加入10％赖氨酸盐溶液，继续避光室温摇晃反应30min；以G25脱盐柱纯化，收集吖啶酯标记的HE4a抗体，加入到0.5mg/ml酪蛋白的100mmol/L的PBS缓冲液，调pH值为7.4。3)常规方法配置洗涤液和化学底物溶液。本发明通过调节磁分离试剂的组分含量，极大地提高了磁分离试剂的稳定性。另外针对吖啶酯发光强度低的缺点，本发明通过大量筛选获得了一种可以极大提高其发光强度的化学激发溶液，本发明意外发现在NaOH溶液中添加了表面活性剂十二烷基二甲基苯基溴化鏻后，检测试剂盒的发光强度得到了极大的改善。具体实施方式下面将进一步的来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。实施例1试剂盒制备1)包被HE4a抗体的磁分离试剂的制备：采用常规化学交联法将HE4a单克隆抗体和磁性微球偶联，磁性微球直径在1.0μm左右，制备后用PBS缓冲液冲洗三次，然后用70mmol/L的PBS缓冲液重新悬浮，加入终浓度0.1mg/ml的丙二醇和0.1mg/ml的PEG200，调pH值至7.4即得；2)吖啶酯标记的HE4a抗体溶液的制备：向pH值为7.5的100mM的1LPBS缓冲液中加入0.3g的HE4a单克隆抗体和0.5mM的4-(2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐，避光情况下室温摇晃反应20min，反应完毕后，加入10％赖氨酸盐溶液100μl，继续避光室温摇晃反应30min；以G25脱盐柱纯化，收集吖啶酯标记的HE4a抗体，加入到0.5mg/ml酪蛋白的100mmol/L的PBS缓冲液，调pH值为7.4。3)常规方法配置洗涤液和化学底物溶液。制备后试剂盒组成如下：包被HE4a抗体的磁分离试剂为含有0.8mg/ml的偶联有抗HE4a单克隆抗体的磁性微球，0.1mg/ml的丙二醇，0.1mg/ml的PEG200的100mmol/L的PBS缓冲液，pH值为7.4。吖啶酯标记的HE4a抗体溶液是含有0.5mg/ml4-(2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐标记的抗HE4a单克隆抗体和0.5mg/ml酪蛋白的100mmol/L的PBS缓冲液，pH值为7.4。洗涤液由在浓度为50mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1％的Tween-20配制而成。所述化学发光激发溶液分为发光激发溶液A和发光激发溶液B；发光激发溶液A为含有0.1MHNO3和1mg/mL的过氧化氢溶液；所述发光激发溶液B为含有5mg/mL的十二烷基二甲基苯基溴化鏻和0.25MNaOH溶液。实施例2试剂盒检测方法a.向微孔板分别加入血清样本和HE4a标准品，每孔30μl；b.依次向每孔加入吖啶酯标记的HE4a抗体溶液和包被HE4a抗体的磁分离试剂各50μl，振荡30s后，置37℃水浴30分钟。c.采用磁分离器，沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的微孔板连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。d.加200μl洗涤液至每孔中，振荡混匀30s，磁分离去洗涤液，重复三次。e.加发光激发溶液A、B每孔各50μl，充分混匀，立刻加入化学发光仪中检测信号值。实施例3包被HE4a抗体的磁分离试剂的稳定性考察采用不同的溶液组成的磁分离试剂，在37℃下以60转/分钟摇动放置一个月，采用实施例2的方法测定HE4a标准品(浓度5ng/ml)，其他检测试剂同实施例1，计算不同放置时间测定的化学信号值与0天时测定的化学信号值的百分比。各组磁分离试剂组成如下：组1：同实施例1组2：0.8mg/ml的偶联有抗HE4a单克隆抗体的磁性微球，0.1mg/ml的丙二醇，0.3mg/ml的PEG200的100mmol/L的PBS缓冲液，pH值为7.4组3：0.8mg/ml的偶联有抗HE4a单克隆抗体的磁性微球，0.1mg/ml的明胶，0.3mg/ml的PEG200的100mmol/L的PBS缓冲液，pH值为7.4组4：0.8mg/ml的偶联有抗HE4a单克隆抗体的磁性微球，0.1mg/ml的丙二醇的100mmol/L的PBS缓冲液，pH值为7.4具体结果如下：N＝5组1组2组3组45天99.5％92.3％91.2％88.9％15天98.7％85.2％81.4％77.1％30天97.6％75.4％70.1％62.3％实施例4性能考察采用实施例1制备的He4a检测试剂盒进行下列测定：1)分别取He4a标准品浓度依次为0.3ng/ml、0.6ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml；按照实施例2的方法进行测定，以化学发光值(RLU)为Y轴，以标准品浓度为x轴，绘制标准曲线；结果表明：本发明实施例1试剂盒线性良好，线性方程为y＝65242X+4195；线性系数R>0.9992)对20次零标准品的测定，取其2倍的平均偏差，其在标准曲线上所对应的浓度即为分析灵敏度，结果表明实施例1试剂盒灵敏度为0.021ng/ml实施例5化学发光激发溶液性能考察分别配置不同组分的发光激发溶液B，其他检测试剂同实施例1，并采用实施例2的方法进行检测，检测样品为0.3ng/ml的He4a标准品，测定各组的化学发光值，具体结果如下：实施例1对比例1对比例2RLU23892109848143对比例1：发光激发溶液B为5mg/mL的TritonX-100和0.25MNaOH溶液，其他试剂组分同实施例1对比例2：发光激发溶液B为5mg/mL的吐温20和0.25MNaOH溶液，其他试剂组分同实施例1本
发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。当前第1页1 2 3