一种低成本无酶免标快速检测敌敌畏的新方法与流程

本发明涉及化学分析领域，具体涉及一种低成本无酶免标快速检测敌敌畏(ddvp)的新方法，本发明属于检测技术领域。

背景技术：

敌敌畏(ddvp)，学名o,o-二甲基-o-(2,2-二氯乙烯基)磷酸酯，有机磷杀虫剂的一种，分子式c4h7cl2o4p。敌敌畏为广谱性杀虫、杀螨剂。具有触杀、胃毒和熏蒸作用，对害虫等击倒力强而快，其主要机理是在体内与胆碱酯酶形成磷酰化胆碱酯酶，胆碱酯酶活性受抑制，使酶不能起到分解乙酰胆碱的作用，导致组织中乙酰胆碱过量蓄积，胆碱使得神经过度兴奋，引起毒蕈碱样、烟碱样和中枢神经系统症状。有机磷农药(ops)是我国常用农药之一，主要用于防治植物病、虫、害等，对农作物的丰产丰收起着重要的作用。目前，ops仍是农作物病虫害防治的主要措施。由于农药具有毒性高、持久性长的特点,过多使用农药导致农产品中农药残留不仅会引发了严重的饮食安全问题，其所引起的环境污染问题也日益严重。但是，目前所用检测方法已无法满足大批量农产品和国内外有关食品的现场快速检测需要。亟需开发出简便、快捷、灵敏的检测技术。目前对于有机磷农药敌敌畏的检测方法的文献报道较多(analyticalchemistry,2009，82，290-296.；analyticalandbioanalyticalchemistry,2007，389,1663-1683.；analyticalchemistry，2012，84，5816-5822.；analyticalchemistry,2014，86，11727-11733.；biosensorsandbioelectronics,2015,68,168-174.)，但是多是基于有机磷对乙酰胆碱酶的抑制作用，酶易变性不易保存，酶的使用不仅增加检测成本对检测结果的准确度也有一定的影响。

技术实现要素：

对目标物实现高灵敏、高精准、简单的快速检测方法是分析化学的一个重要发展方向。针对以上存在的问题，我们开发了一种无酶、免标、成本低的快速检测敌敌畏的新方法。其操作过程简单，成本低，检测结果具有良好的重现性，确保了检测结果的准确度。为达到上述目的，本发明创造的技术方案如下：

本发明提供了一种低成本无酶免标快速检测敌敌畏(ddvp)的新方法。本方法将amplexred(ar)，硫化铜纳米材料(cusnps)与ddvp三者共同混合，在室温孵育2.5h，ar被氧化产生荧光，其荧光增强与ddvp浓度呈线性相关，通过检测ar荧光强度即可实现对ddvp的快速检测。

本发明具体包括以下步骤：

(1)制备1μmar和180μg/mlcusnps的混合溶液，加入0-0.1μg/ml不同浓度的ddvp，室温下孵育2.5小时，然后用荧光分光光度仪检测ar的荧光强度，激发波长为540nm，发射波长为584nm，amplexred(ar)，硫化铜纳米材料(cusnps)与ddvp三者浓度是三者在反应体系中的最终浓度，反应的体系包括ar，硫化铜材料和不同浓度的ddvp。

(2)以ar荧光响应为纵坐标，以ddvp浓度为横坐标对检测数据进行处理，然后进行线性拟合，得到线性回归方程；

(3)在检测实际样品时，在待测样品溶液中同时加入1μmar和180μg/mlcusnps溶液，室温孵育2.5小时后，用荧光分光光度仪检测非标记荧光染料amplexred的荧光强度，激发波长为540nm，发射波长为584nm；根据步骤(2)得到的线性回归方程计算待测溶液中ddvp的浓度。i

进一步，本发明所述硫化铜纳米材料制备方法为：分别量取0.02m/l的硝酸铜2ml和0.01m/l的硫化铜2ml，将两者迅速混合后，溶液呈现墨绿色，并充分的涡旋30mins再超声30mins后离心，转速为10000rpm/min，离心30mins后，将上清液弃掉，沉淀用乙醇清洗，并离心，反复三次；将得到的沉淀硫化铜纳米颗粒真空干燥，之后称量质量为0.0072g，并再次将其溶解在4ml的水中超声溶解，溶液呈现墨绿色，得到硫化铜纳米颗粒的浓度为1800μg/ml。

本发明所述的方法是一种快速检测敌敌畏的新方法。相对于现有技术，本发明创造所述的ddvp的检测方法具有以下优势：本发明利用ddvp，ar和cusnps的共同作用，具有操作简单、无酶、免标记、灵敏度高、方法简单和特异性强且成本低的优势。

附图说明

构成本发明创造的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：

图1为本发明创造实施例所述的cusnps的紫外光谱图。

图2为本发明创造实施例所述的ddvp，cusnps增强ar荧光，检测ddvp的原理验证相关实验数据。

图3为本发明创造实施例所述的优化cusnps所用检测浓度的ar的荧光响应数据。

图4为本发明创造实施例所述的为检测ddvp的反应时间优化数据。

图5为本发明创造实施例所述的ar荧光强度随ddvp浓度变化的荧光曲线。

图6为本发明创造实施例所述的ar荧光强度随ddvp浓度变化在584nm处荧光值的线性拟合曲线及方程。

图7为本发明创造实施例所述的检测敌敌畏特异性干扰实验数据。

具体实施方式

为了使本发明上述特征和发明创造中优化条件更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。

以下amplexred(ar)，硫化铜纳米材料(cusnps)与ddvp三者反应的体系是500μl(包括ar，硫化铜材料和不同浓度的ddvp)，下面给出的三者的浓度都是在500μl体系下的浓度。

实施例1

硝酸铜(0.02m/l，2ml与硫化铜(0.01m/l，2ml)分别溶解在水中，分别混匀后，将两者迅速混合后，溶液呈现墨绿色，并充分的涡旋30mins再超声30mins后离心转速为10000rpm/min，30mins后，将上清液弃掉；沉淀用乙醇清洗，并离心，反复三次；将沉淀硫化铜纳米颗粒真空干燥，之后称量质量为0.0072g，并再次将其溶解在4ml的水中超声溶解，溶液呈现墨绿色，硫化铜纳米颗粒的浓度为1800μg/ml。紫外可见分光光度计测定其紫外吸收光谱。

实施例2

1μmar荧光染料(a)；1μmar荧光染料与180μg/mlcusnps混合后(b)；1μmar荧光染料与0.05μg/mlddvp混合后(c)；1μmar荧光染料,180μg/mlcusnps与0.05μg/mlddvp混合后(d)，利用荧光分光光度仪测ar荧光强度(如图1所示)。激发波长为540nm，发射波长为584nm。

实施例3

1μmar，0.05μg/mlddvp与不同浓度的cusnps(0，3.6，18，36，72，144，180，216，288，360μg/ml)混合反应，测定ar的荧光强度。激发波长540nm，发射波长为584nm。

实施例4

1μmar，180μg/ml的cusnps与0.05μg/mlddvp混合孵育不同的时间(0，0.5，1，1.5，2，2.5，3h)，测定ar的荧光强度。激发波长540nm，发射波长为584nm。

实施例5

1μmar，180μg/mlcusnps与0-0.1μg/ml的ddvp混合反应2.5h，测定ar的荧光强度。激发波长540nm，发射波长为584nm。

实施例6

1μmar，180μg/mlcusnps与0-0.1μg/ml的ddvp混合反应2.5h，测定ar在584nm处的荧光强度，通过线性拟合获得线性方程：

y＝10.091x+0.0086(r²＝0.9954)式(1))

实施例7

选择a:空白，b:毒死蜱,c:敌敌畏,d:甲基对硫磷,e:敌百虫,f:亚胺硫磷,g:氧化乐果,h:乐果,i:甲拌磷,j:灭草隆,k:敌草隆,l:非草隆,m:枯草隆,n:立谷隆,o:绿谷隆,p:恩诺沙星,q:氨苄青霉素,r:啶虫脒,s:硫酸链霉素,t:卡那霉素,u:甲二唑,v:二甲恶唑,w:二甲嘧啶,x:异恶唑啶等作为本实验检测的干扰物质，并研究该方法的特异性。干扰物质浓度均为0.1μg/ml,分别与1μmar和180μg/mlcusnps混合反应2.5h后，利用荧光分光光度仪测其荧光强度。如图7所示，只有0.03μg/mlddvp可以明显增强ar的荧光强度，而其他干扰农药没用增强ar的荧光强度，表明该方法对ddvp检测特异性强、灵敏度高、方法非常简单。

实施例8

以标准加入法对所发展检测新方法进行验证，在待测溶液中分别添加ddvp量为：0.01,0.05,0.1μg/ml；再加入ar(1μm)与cusnps(180μg/ml)的混合溶液，在相同条件下进行样品检测。根据检测结果确定根据所得线性方程式(1)计算得出ddvp实际检出浓度，据此计算加标回收率(见表1)，证明此方法可应用于实际样品检测。

表1

实际样品中添加ddvp后，利用得到的线性方程计算出ddvp的实际检出量，可以得到回收率在90-105％范围内，说明此方法用于检测ddvp的浓度是准确。

本方法检测ddvp，同样也可以将其应用在试纸条的开发，将ar与硫化铜纳米材料进行混合浸泡在不同的材质的试纸条上，将样品进行点样，在紫外灯下ar产生不同程度的红色荧光可以肉眼进行快速，方便检测ddvp，并且本方法的原理可以将其进行试剂盒的开发来满足现场等快速、灵敏检测ddvp。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例，并不用于限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。