本发明涉及免疫学领域，尤其涉及了一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂。
背景技术：
：β兴奋剂(β肾上腺受体激动剂)的药物，主要包括盐酸克伦特罗、莱克多巴胺以及沙丁胺醇、溴布特罗、马布特罗等，β兴奋剂容易在动物机体内大量蓄积，维持较高的残留量，所以畜产品一旦携有，一般烹饪方法和过程都很难将其清除或使其失活、溶解、损耗，因而严重影响到人类的健康。欧美等国早已立法禁止在畜禽生产上使用β兴奋剂，而我国农业部也作出相同的规定，尽管如此，受经济利益的驱使，违法滥用β兴奋剂现象仍然比较普遍。目前针对β兴奋剂的检测技术主要有色谱技术和免疫分析技术等，色谱技术最常用，主要有高压液相色谱(hplc)，高压液相色谱/荧光(hplc/fld)，液相色谱-质谱连用(lc-ms)，气象色谱-质谱(gc-ms)连用，毛细管电泳等方法。这些方法灵敏准确，但是样品处理繁琐费时，成本高，而且需要有经过专门训练的专业人士来操作复杂的仪器设备。而酶联免疫分析技术灵敏、特异、快速，一次能检测大量样品，但该方法也需酶标仪等仪器设备，分析时间一般为1～4小时，对β兴奋剂检测仍具有一定的局限，因此，急需发展一种简便、快速、适于现场的β兴奋剂检测方法。技术实现要素：本发明针对现有技术中操作复杂、成本高、时间长的缺点，提供了一种简便、快速、适于现场的时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂。为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，包括以下步骤，步骤一，eu3+标记的羊抗鼠igg：取溶解于50mol/l、ph7.0的pbs缓冲液的5g/l羊抗鼠igg，经蛋白质脱盐柱(pd-10)柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/l、ph9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗鼠igg至1mg/ml，取1.0ml稀释后的羊抗鼠igg与0.5mg的eu3+-dtta混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/l、ph8.0含有0.9％nacl的tris-hcl缓冲液作为洗脱液在6％交联琼脂糖(sepharosecl-6b)柱中分馏，分馏物即为eu3+标记的羊抗鼠igg；步骤二，sm3+标记的羊抗兔igg：取溶解于50mol/l、ph7.0的pbs缓冲液的5g/l羊抗兔igg，经pd-10柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/l、ph9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗兔igg至1mg/ml，取1.0ml稀释后的羊抗兔igg与0.5mg的sm3+-dtta混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/l、ph8.0含有0.9％nacl的tris-hcl缓冲液作为洗脱液在sepharosecl-6b柱中分馏，分馏物即为sm3+标记的羊抗兔igg；步骤三，参考标准品的制备：用0.05mol/l、ph7.8含有0.9％nacl的tris-hcl缓冲液将莱克多巴胺单克隆抗体:沙丁胺醇单克隆抗体配制成0.1:0.5，0.2:1，0.5:2.5，2.5:12.5，5:25ng/ml的系列标准溶液；步骤四，固相包被板的制备：将莱克多巴胺-卵清蛋白偶联物、沙丁胺醇-卵清蛋白偶联物与0.1mol/l、ph7.8含有0.05％nan3和0.9％nacl的碳酸盐缓冲液4℃下充分混合12h，混合后所得液体稀释至1mg/l作为包被液，96孔微孔板各孔加入80ul包被液，室温下放置14h，弃去包被液，用0.05mol/l含有0.05％tween20的tris-hcl缓冲液洗涤5次，之后加入100ul、0.05mol/l、ph7.2含有0.5％ova，0.9％nacl，0.05％nan3的tris-hcl缓冲液封闭，37℃下放置1h，弃去封闭液，真空抽干，包被板密封后-20℃冷冻保存。步骤五，取步骤四所得的包被板，加入步骤三所得标准品或已处理好的样品到各自微孔中，再加入步骤一所得标记物和步骤二所得标记物，震荡孵育后用洗脱液洗涤次，再加入增强液，震荡孵育，用半自动荧光检测仪进行检测。作为优选，取步骤四所得包被板，加入50ul步骤三所得标准品或已处理好的样品，加入100ul步骤一所得标记物和步骤二所得标记物，室温下震荡孵育30min，用0.05mol/l、ph7.4含有0.9％nacl和0.4％～0.6％甲醇的tris-hcl洗涤液洗涤5次，再加200ul增强液，震荡孵育10min，用半自动荧光检测仪进行检测。作为优选，增强液为0.1mol/l、ph3.2含有15umolβ-萘甲酰三氟丙酮和0.1％tritonx-100的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。作为优选，样品为尿液或血液，样品处理：尿液以3000r/min离心5min，之后用生理盐水稀释10倍；将0.5ml血液用0.5ml、ph7.4、10mmol/l的pbs缓冲液稀释10倍。eu3+-dtta、sm3+-dtta均购自tianjinradio-medicalinstitute。时间分辨荧光免疫层析法其原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，其一端和镧系元素结合，另一端和抗体分子上的自由氨基联接，制成eu3+标记抗体，它与待测样品中的抗原结合成免疫复合物，测定复合物中镧系元素的荧光强度就能确定样品中抗原的量。本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：甲醇可以提高标记物的溶解度和评估其在时间分辨荧光免疫层析法中的效果；在时间分辨荧光免疫层析法采用eu3+标记羊抗鼠igg和sm3+标记羊抗兔igg，测量时，通过检测eu3+和sm3+可以同时检测样品中是否含有莱克多巴胺(rac)和沙丁胺醇(stl)。本发明具有稳定性佳、灵敏度高及重复性好的优点。具体实施方式下面实施例是对本发明进一步详细描述，但不是限制本发明的范围。对比例1elisa试剂盒测定β兴奋剂：将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20～25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放回铝箔袋，封口，保存于2～8℃；洗涤工作液在使用前也需回温；将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置；酶结合物工作液配制：根据需要量用浓缩酶结合物稀释液将浓缩酶结合物按1:10的比例稀释成酶结合物工作液(即1份浓缩酶结合物加入到10份浓缩酶结合物稀释液中)；加标准品/样本及酶结合物工作液：加入标准品/样本50μl到对应的微孔中，然后加入配制好的酶结合物工作液100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应40min；洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。显色：加入底物液a液50μl/孔，再加底物液b液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min。测定：加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔od值。(若无酶标仪，则不加终止液。实施例1一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，包括以下步骤，步骤一，eu3+标记的羊抗鼠igg：取溶解于50mol/l、ph7.0的pbs缓冲液的5g/l羊抗鼠igg，经pd-10柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/l、ph9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗鼠igg至1mg/ml，取1.0ml稀释后的羊抗鼠igg与0.5mg的eu3+-dtta混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/l、ph8.0含有0.9％nacl的tris-hcl缓冲液作为洗脱液在sepharosecl-6b柱中分馏，分馏物即为eu3+标记的羊抗鼠igg；步骤二，sm3+标记的羊抗兔igg：取溶解于50mol/l、ph7.0的pbs缓冲液的5g/l羊抗兔igg，经pd-10柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/l、ph9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗兔igg至1mg/ml，取1.0ml稀释后的羊抗兔igg与0.5mg的sm3+-dtta混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/l、ph8.0含有0.9％nacl的tris-hcl缓冲液作为洗脱液在sepharosecl-6b柱中分馏，分馏物即为sm3+标记的羊抗兔igg；步骤三，参考标准品的制备：用0.05mol/l、ph7.8含有0.9％nacl的tris-hcl缓冲液将莱克多巴胺单克隆抗体:沙丁胺醇单克隆抗体配制成0.1:0.5，0.2:1，0.5:2.5，2.5:12.5，5:25ng/ml的系列标准溶液；步骤四，固相包被板的制备：将莱克多巴胺-卵清蛋白偶联物、沙丁胺醇-卵清蛋白偶联物与0.1mol/l、ph7.8含有0.05％nan3和0.9％nacl的碳酸盐缓冲液4℃下充分混合12h，混合后所得液体稀释至1mg/l作为包被液，96孔微孔板各孔加入80ul包被液，室温下放置14h，弃去包被液，用0.05mol/l含有0.05％tween20的tris-hcl缓冲液洗涤5次，之后加入100ul、0.05mol/l、ph7.2含0.5％ova、0.9％nacl和0.05％nan3的tris-hcl缓冲液封闭，37℃下放置1h，弃去封闭液，真空抽干，包被板密封后-20℃冷冻保存。步骤五，取步骤四所得包被板，加入50ul步骤三所得标准品或已处理好的样品，再加入100ul步骤一所得标记物和步骤二所得标记物，室温下震荡孵育30min，用0.05mol/l、ph7.4含有0.9％nacl和0.4％～0.6％甲醇的tris-hcl洗涤液洗涤5次，再加200ul增强液，震荡孵育10min，用半自动荧光检测仪进行检测。增强液为0.1mol/l、ph3.2含有15umolβ-萘甲酰三氟丙酮和0.1％tritonx-100的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。样品为尿液，样品处理为尿液以3000r/min离心5min，之后用生理盐水稀释10倍。实施例2一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，包括以下步骤，步骤一，取溶解于50mol/l、ph7.0的pbs缓冲液的5g/l羊抗鼠igg，经pd-10柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/l、ph9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗鼠igg至1mg/ml，取1.0ml稀释后的羊抗鼠igg与0.5mg的eu3+-dtta混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/l、ph8.0含有0.9％nacl的tris-hcl缓冲液作为洗脱液在sepharosecl-6b柱中分馏，分馏物即为eu3+标记的羊抗鼠igg；步骤二，sm3+标记的羊抗兔igg：取溶解于50mol/l、ph7.0的pbs缓冲液的5g/l羊抗兔igg，经pd-10柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/l、ph9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗兔igg至1mg/ml，取1.0ml稀释后的羊抗兔igg与0.5mg的sm3+-dtta混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/l、ph8.0含有0.9％nacl的tris-hcl缓冲液作为洗脱液在sepharosecl-6b柱中分馏，分馏物即为sm3+标记的羊抗兔igg；步骤三，参考标准品的制备：用0.05mol/l、ph7.8含有0.9％nacl的tris-hcl缓冲液将莱克多巴胺单克隆抗体:沙丁胺醇单克隆抗体配制成0.1:0.5，0.2:1，0.5:2.5，2.5:12.5，5:25ng/ml的系列标准溶液；步骤四，将莱克多巴胺-卵清蛋白偶联物、沙丁胺醇-卵清蛋白偶联物与0.1mol/l、ph7.8含有0.05％nan3和0.9％nacl的碳酸盐缓冲液4℃下充分混合12h，混合后所得液体稀释至1mg/l作为包被液，96孔微孔板各孔加入80ul包被液，室温下放置14h，弃去包被液，用0.05mol/l含有0.05％tween20的tris-hcl缓冲液洗涤5次，之后加入100ul、0.05mol/l、ph7.2含有0.5％ova、0.9％nacl和0.05％nan3的tris-hcl缓冲液封闭，37℃下放置1h，弃去封闭液，真空抽干，包被板密封后-20℃冷冻保存。取步骤四所得包被板，加入50ul步骤三所得标准品或已处理好的样品，再加入100ul步骤一所得标记物和步骤二所得标记物，室温下震荡孵育30min，用0.05mol/l、ph7.4含有0.9％nacl和0.4％甲醇的tris-hcl洗涤液洗涤5次，再加200ul增强液，震荡孵育10min，用半自动荧光检测仪进行检测。增强液为0.1mol/l、ph3.2含有15umolβ-萘甲酰三氟丙酮和0.1％tritonx-100的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。样品为动物组织，样品处理为按照gb/t5009.192-2003标准。实施例3一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，包括包括以下步骤，步骤一，eu3+标记的羊抗鼠igg：取溶解于50mol/l、ph7.0的pbs缓冲液的5g/l羊抗鼠igg，经pd-10柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/l、ph9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗鼠igg至1mg/ml，取1.0ml稀释后的羊抗鼠igg与0.5mg的eu3+-dtta混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/l、ph8.0含有0.9％nacl的tris-hcl缓冲液作为洗脱液在sepharosecl-6b柱中分馏，分馏物即为eu3+标记的羊抗鼠igg；步骤二，sm3+标记的羊抗兔igg：取溶解于50mol/l、ph7.0的pbs缓冲液的5g/l羊抗兔igg，经pd-10柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/l、ph9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗兔igg至1mg/ml，取1.0ml稀释后的羊抗兔igg与0.5mg的sm3+-dtta混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/l、ph8.0含有0.9％nacl的tris-hcl缓冲液作为洗脱液在sepharosecl-6b柱中分馏，分馏物即为sm3+标记的羊抗兔igg；步骤三，参考标准品的制备：用0.05mol/l、ph7.8含有0.9％nacl的tris-hcl缓冲液将莱克多巴胺单克隆抗体:沙丁胺醇单克隆抗体配制成0.1:0.5，0.2:1，0.5:2.5，2.5:12.5，5:25ng/ml的系列标准溶液；步骤四，固相包被板的制备：将莱克多巴胺-卵清蛋白偶联物、沙丁胺醇-卵清蛋白偶联物与0.1mol/l、ph7.8含有0.05％nan3和0.9％nacl的碳酸盐缓冲液4℃下充分混合12h，混合后所得液体稀释至1mg/l作为包被液，96孔微孔板各孔加入80ul包被液，室温下放置14h，弃去包被液，用0.05mol/l含有0.05％tween20的tris-hcl缓冲液洗涤5次，之后加入100ul、0.05mol/l、ph7.2含有0.5％ova、0.9％nacl和0.05％nan3的tris-hcl缓冲液封闭，37℃下放置1h，弃去封闭液，真空抽干，包被板密封后-20℃冷冻保存。取步骤四所得包被板，加入50ul步骤三所得标准品或已处理好的样品，再加入100ul步骤一所得标记物和步骤二所得标记物，室温下震荡孵育30min，用0.05mol/l、ph7.4含有0.9％nacl和0.6％甲醇的tris-hcl洗涤液洗涤5次，再加200ul增强液，震荡孵育10min，用半自动荧光检测仪进行检测。增强液为0.1mol/l、ph3.2含有15umolβ-萘甲酰三氟丙酮和0.1％tritonx-100的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。样品为血液，样品处理为将0.5ml血液用0.5ml、ph7.4、10mmol/l的pbs缓冲液稀释10倍。以上羊抗鼠igg、羊抗兔igg购自于sigma公司；eu3+-dtta、sm3+-dtta购自于tianjinradio-medicalinstitute，蛋白质脱盐柱(pd-10)购自于rullwellco.ltd，6％交联琼脂糖(sepharosecl-6b)购自于北京奇松生物科技有限公司。实验结果1.灵敏度国家对莱克多巴胺、沙丁胺醇规定的最高残留量均为0.05ng/ml，从表1张可以看出，本发明满足对莱克多巴胺、沙丁胺醇的测试要求，现有技术中采用ic/ms测试方法，对此两种物质的检测线为10ng/ml，因此相比与ic/ms法、elisa法，本发明具有较高的灵敏度。2.回收率在1ml尿样(0ng/mlrac，0ng/mlstl)和1ml尿样(1ng/mlrac，1ng/mlstl)，分别加入0.1ml混合液a，混合物b，混合物c。其中混合液a中含有0ng/mlrac和0ng/mlstl；混合液b中含有1ng/mlrac和1ng/mlstl；混合液c中含有10ng/mlrac和10ng/mlstl。重复计算5次，计算回收率。样品(rac,stl)含量(rac,stl)添加含量(rac,stl)测定值(rac,stl)回收率0ng/ml，0ng/ml0.1ng/ml，0.1ng/ml0.11ng/ml，0.11ng/ml110％，110％0ng/ml，0ng/ml1.0ng/ml，1.0ng/ml0.9ng/ml，0.9ng/ml90％，90％0ng/ml，0ng/ml10.0ng/ml，10.0ng/ml9.3ng/m，9.3ng/ml93％，93％0.1ng/ml，0.1ng/ml0.1ng/ml，0.1ng/ml0.2ng/ml，0.2ng/ml100％，100％0.1ng/ml，0.1ng/ml1.0ng/ml，1.0ng/ml1.09ng/ml，1.09ng/ml99.1％，99.1％0.1ng/ml，0.1ng/ml10.0ng/ml，10.0ng/ml9.9ng/ml，9.9ng/ml98％，98％从表2可以看出，rac,stl空白平均加标回收率均为97.7％，rac,stl样品平均加标回收率均为99％，表明本试剂具有良好的准确性。3.分析精密度以样品加标回收率实验中3个分析样本为质控，采用直接竞争法进行测定，各设10个重复孔，分析内精密度与分析间精密度测试结果分别如表3和表4所示。表3分析内精密度测试结果(rac,stl)浓度(rac,stl)平均测定浓度(rac,stl)标准偏差(rac,stl)相对标准偏差0.2，0.20.21，0.210.005，0.0052.38，2.381.1，1.11.06，1.050.039，0.0413.68，3.9010.1，10.19.83，9.700.354，0.3633.60，3.74表4分析间精密度测试结果(rac,stl)浓度(rac,stl)平均测定浓度(rac,stl)标准偏差(rac,stl)相对标准偏差0.2，0.20.19，0.200.006，0.0073.16，3.681.1，1.11.08，1.090.046，0.0474.25，4.3110.1，10.19.87，9.800.525，0.5315.32，5.42从表3和表4可以看出，rac的分析内相对标准偏差2.38％～3.60％，平均3.22％，stl的分析内相对标准偏差2.38％～3.74％，平均3.34％；rac的分析间相对标准偏差为3.16％～5.25％，平均4.24％，stl的分析间相对标准偏差为3.68％～5.42％，平均4.47％。从分析内与分析间相对标准偏差可以看出本试剂重复性好、精密度高。总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。当前第1页12