用于观察小麦矮腥黑粉菌侵染小麦子房的方法与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种用于观察小麦矮腥黑粉菌在小麦子房内的侵染、发病和为害过程的方法。

背景技术：

小麦矮腥黑穗病(wheatdwarfbuntdisease,db)是危害世界麦类作物的重要检疫性病害，主要危害小麦(triticumaestivum)，可造成植株矮化、分蘖增多等病症，且防治困难，一旦传入将会给小麦生产带来毁灭性危害，其冬孢子具鱼腥臭味，会极大地影响小麦品质。小麦矮腥黑穗病病害风险评估表明，中国有19.3％的冬小麦种植区有适宜该病害发生的自然条件，属高风险发生区。小麦矮腥黑粉菌(tilletiacontroversakühn,tck)属担子菌亚门(basidiomycotina)、冬孢菌纲(teliomycetes)、黑粉菌目(ustilaginales)、腥黑粉菌科(tilletiaceae)、腥黑粉菌属(tilletia)。小麦矮腥黑粉菌的寄主范围很广，除主要侵染小麦外，还能侵染大麦(hordeumvulgarel.)、黑麦(secalecereale)等禾本科18个属的70多种植物。国内外对小麦腥黑粉菌属病原菌的研究工作主要集中在小麦矮腥黑粉菌及其近源种的种内及种间分子生物学分类方面的相关研究，依据rdna的转录间区测序分析、随机扩增多态性dna标记(randomamplifiedpolymorphicdna,rapd)、重复片段pcr基因指纹分析(repetitiveelementpcrgenomicfingerprinting,reppcr)及real-timepcr等方法研究腥黑粉菌的种内及种间差异,以寻求其变异特征，目前已实现小麦矮腥黑粉菌的早期检测及其冬孢子的分子检测与免疫荧光法检测，小麦矮腥黑粉菌侵染过程的研究将有助于揭示小麦矮腥黑粉菌的致病过程及其与寄主的互作。散落在土壤中的该病菌冬孢子萌发后侵染小麦幼嫩的分孽处，逐步进入穗原始体、花器等组织，破坏子房，最终形成该病菌的冬孢子堆。姚卓等人和杨岩等人在室内条件下小麦矮腥黑粉菌的人工接种。小麦矮腥黑粉菌侵染寄主小麦的细胞学研究仅限于20世纪90年代的组织切片技术。trione等人采用切片技术，发现小麦子房被侵染后菌丝在子实层形成冬孢子；fernandez和duran采用组织切片技术，发现该真菌在小麦生长点存在大量菌丝。截至目前,该病菌侵染过程研究尚未有详细报道。激光扫描共聚焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscope,lscm)可高效、直观地观察真菌的菌丝，gao等人利用激光扫描共聚焦显微技术揭示了玉米瘤黑粉菌对玉米(zeamays)花药细胞发育的影响，该技术还可长期监测病原菌和寄主的相互作用，如观察烟草疫霉、大丽轮枝菌、马铃薯细菌性软腐病菌分别侵染其寄主的生长动态及与寄主的互作方式等研究。

但本领域尚缺乏一种可有效清楚地展现小麦矮腥黑粉菌对小麦子房侵染过程的显微观察方法。

技术实现要素：

基于本领域的空白，本发明的目的在于提供一种方法，用于对小麦矮腥黑粉菌侵染小麦子房进行有效清楚的观察。

本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种用于观察小麦矮腥黑粉菌侵染小麦子房的方法，包括如下步骤：(1)接种：用小麦矮腥黑粉菌对孕穗期小麦的小穗进行接种；(2)采样：上述接种一周后，将确定感染小麦矮腥黑粉菌的小麦的小穗的子房取出浸入无水乙醇中保存；所述小穗为小麦孕穗期开始时的小穗；(3)染色制片：将所述子房置于载玻片上进行染色后制成观察用玻片，并将所述玻片置于激光共聚焦显微镜下观察；所述染色指：将所述子房先置于10μg/mlpropidiumidodide和0.02％tween20染色20min，再用20μg/mlwga-af488染色20min，最后用1×pbs(ph7.4)冲洗4至6次。现有染色方法记载在“蔚慧欣、高利等，2016《小麦矮腥黑粉菌在小麦体内侵染过程的显微观察》一文中，经实验对比，现有染色方法与本发明的染色方法针对同样的小麦品种进行采样、染色、观察获得的图像差别巨大，现有方法并不能满足清楚准确地显示子房内部各细胞的要求，而本发明的方法能够清楚地辨别子房内部的细胞形态和大小，从而便于进一步进行图像的数据统计和分析。

在进一步的实施例中，进行所述采样后，将所述小穗子房包埋进石蜡中并制作成石蜡切片，在对所述石蜡切片进行染色。制作石蜡切片的作用是，用来与激光共聚焦显微镜的观察结果对比。

在更进一步的实施例中，在载玻片上所述石蜡切片的两侧分别使用双面贴，用于加高盖玻片并使所述盖玻片盖上后可通过双面贴与载玻片固定并制成观察用玻片；将所述玻片置于激光共聚焦显微镜下观察。

在另一些实施例中，所述小麦通过下述方法获得：将种子消毒、清洗后进行春化处理，待小麦发芽至芽长1-2cm时种植到具有小麦生长所需养分的土壤中，置于15℃、相对湿度为70％的环境下继续春化生长至少2周后，改为白天25℃、夜间10℃继续培养至所述孕穗期。而现有方法(姚卓、陈万权等，2014，《小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发和室内人工接种方法的探索》一文中记载)的则为待小麦发芽至芽长4-5cm时备用，相比而言，本发明在小麦芽1-2cm时就转入土壤中好处在于，用更幼嫩的小麦芽种植于土壤中，再继续进行春化处理，可使整体春化效果更好，进而使后续生长出来的小麦植株顺利开启孕穗期，缩短种子萌发至进入孕穗期的时间的同时，还可以使进入孕穗期的小麦的小穗状态最佳，所侵染得到的小穗材料经染色制片后观察效果达到最优，对于获得本发明最终的最佳观察效果，这一步骤非常关键。

同时，关于小麦生长种植方法，现有方法(姚卓、陈万权等，2014《小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发和室内人工接种方法的探索》一文记载)为：将接种后的种子播于直径24cm塑料盆中，深度约5cm，每盆种10粒种子。在10℃下培养，直到幼苗出土良好，时间约2周。然后将幼苗移至高温室中培养，白天温度约25℃，夜间温度约13℃，进行常规管理，将植株种植至成熟。相比上述现有方法，本发明采用的小麦种植步骤能获得符合要求的孕穗期小麦材料，尤其能够获得最佳观察时期的小麦子房状态。

在进一步具体的实施例中，步骤(2)中，所述取出小麦小穗的子房的具体操作如下：在体视显微镜下使用镊子对所述小穗进行解剖，去掉小穗的外稃、內稃和花药，从盾片上剥离下来子房并去掉柱头。

在优选的实施例中，所述小麦孕穗期开始时的小穗指，小麦旗叶叶片全部从倒二叶叶鞘内伸出后，小麦茎部由于小穗生长开始膨大时从小麦中剥离获得的小穗。这个阶段的小麦孕穗刚刚开始发育，此时接种可使小麦矮腥黑粉菌尽早地接触小麦材料，使整个侵染过程的开始节点提前，并最大可能地延长黑粉菌侵染小麦的时间，使最终侵染结果观察效果更好。

在一些实施例中，步骤(2)中，所述确定感染小麦矮腥黑粉菌的小麦采用分子生物学手段进行检测。所述分子生物学手段具体指采用改良的ctab法提取小麦子房dna进行样品检测，参照(gaoetal.，2014)中筛选的基于issr的tck特异性scar分子标记引物(gaoli,yuhuixin,hanwensu,gaofei,liutaiguo,liubo,kangxiaohui,gaojiguo,chenwanquan.developmentofascarmarkerformoleculardetectionanddiagnosisoftilletiacontroversakuhn,thecausalfungusofwheatdwarfbunt)，进行常规pcr扩增，凝胶电泳检测得到一条大小为372bp片段的样品植株可以确定为已发病小麦植株。

在本发明所有的实施例中，所述小麦品种为小麦矮腥黑粉菌易感病品种，优选“冬选三号”。

本发明另一方面还提供了上述方法在观察研究小麦矮腥黑粉菌侵染小麦方面的应用。

本发明最大的贡献是提供了一种通过病原菌菌丝侵染植物组织的三维立体观察构象的手段来研究病原菌的侵染过程的技术，采用本发明的方法，能对小麦矮腥黑粉菌侵染小麦、尤其是小麦子房的全部过程进行跟踪、观察，并且与现有方法相比较，本发明的方法能够清楚地辨别子房内部的细胞形态和大小，从而便于进一步进行图像的数据统计和分析。

附图说明

图1是采用本发明的1个实施例的方法所得到的石蜡切片成像：左边是直径大小为1000μm的小麦子房图；右边是直径大小为700μm的小麦子房图。

图2是采用本发明的1个实施例的方法所得到的激光共聚焦成像：左边是直径大小为900μm的小麦子房图；右边是直径大小为430的小麦胚珠图。

图3是采用现有技术方法所得到的激光共聚焦成像。

图4是采用本发明的1个实施例的方法所得到的激光共聚焦成像。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。

生物材料的来源

本文中所使用的小麦品种“冬选三号”为现有已知品种，可商购获得。

主要试剂

次氯酸钠溶液、二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ、无水乙醇ⅰ、95％酒精、90％酒精、80％酒精、70％酒精均为国产分析纯；

番红染液购自北京百斯威生物科技有限公司；

wga-af488、propidiumidodide购自lifetechnologiescorporation(北京江晨源远生物科技有限公司代购)；

0.02％tween20染购自北京冰达生物科技有限公司；

pbs购自gehealthcarelifesciencescompany(北京江晨源远生物科技有限公司代购)。

本发明第一个系列的实施例提供一种用于观察小麦矮腥黑粉菌侵染小麦子房的方法，在该系列所有实施例中，所述方法包括如下步骤：

(1)接种：用小麦矮腥黑粉菌对孕穗期小麦的小穗进行接种；(2)采样：上述接种一周后，将确定感染小麦矮腥黑粉菌的小麦的小穗的子房取出浸入无水乙醇中保存；所述小穗为小麦孕穗期开始时的小穗；(3)染色制片：将所述子房置于载玻片上进行染色后制成观察用玻片，并将所述玻片置于激光共聚焦显微镜下观察；所述染色指：将所述子房先置于10μg/mlpropidiumidodide和0.02％tween20染色20min，再用20μg/mlwga-af488染色20min，最后用1×pbs(ph7.4)冲洗4至6次。现有染色方法记载在“蔚慧欣、高利等，2016《小麦矮腥黑粉菌在小麦体内侵染过程的显微观察》一文中，经实验对比，现有染色方法与本发明的染色方法针对同样的小麦品种进行采样、染色、观察获得的图像差别巨大，现有方法并不能满足清楚准确地显示子房内部各细胞的要求，而本发明的方法能够清楚地辨别子房内部的细胞形态和大小，从而便于进一步进行图像的数据统计和分析。

在进一步的实施例中，进行所述采样后，将所述小穗子房包埋进石蜡中并制作成石蜡切片，在对所述石蜡切片进行染色。制作石蜡切片的作用是，用来与激光共聚焦显微镜的观察结果对比。经实验对比，石蜡切片由于其本身的操作特点，会造成小麦的子房细胞部分被破坏和损伤，具有局限性，因此最优选的还是采用上述染色方法进行激光共聚焦显微观察。

在更进一步的实施例中，在载玻片上所述石蜡切片的两侧分别使用双面贴，用于加高盖玻片并使所述盖玻片盖上后可通过双面贴与载玻片固定并制成观察用玻片；将所述玻片置于激光共聚焦显微镜下观察。

在另一些实施例中，所述小麦通过下述方法获得：将种子消毒、清洗后进行春化处理，待小麦发芽至芽长1-2cm时种植到具有小麦生长所需养分的土壤中，置于15℃、相对湿度为70％的环境下继续春化生长至少2周后，改为白天25℃、夜间10℃继续培养至所述孕穗期。而现有方法(姚卓、陈万权等，2014，《小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发和室内人工接种方法的探索》一文中记载)的则为待小麦发芽至芽长4-5cm时备用，相比而言，本发明在小麦芽1-2cm时就转入土壤中好处在于，用更幼嫩的小麦芽种植于土壤中，再继续进行春化处理，可使整体春化效果更好，进而使后续生长出来的小麦植株顺利开启孕穗期，缩短种子萌发至进入孕穗期的时间的同时，还可以使进入孕穗期的小麦的小穗状态最佳，所侵染得到的小穗材料经染色制片后观察效果达到最优，对于获得本发明最终的最佳观察效果，这一步骤非常关键。

同时，关于小麦生长种植方法，现有方法(姚卓、陈万权等，2014《小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发和室内人工接种方法的探索》一文记载)为：将接种后的种子播于直径24cm塑料盆中，深度约5cm，每盆种10粒种子。在10℃下培养，直到幼苗出土良好，时间约2周。然后将幼苗移至高温室中培养，白天温度约25℃，夜间温度约13℃，进行常规管理，将植株种植至成熟。相比上述现有方法，本发明采用的小麦种植步骤能获得符合要求的孕穗期小麦材料，尤其能够获得最佳观察时期的小麦子房状态。

在进一步具体的实施例中，步骤(2)中，所述取出小麦小穗的子房的具体操作如下：在体视显微镜下使用镊子对所述小穗进行解剖，去掉小穗的外稃、內稃和花药，从盾片上剥离下来子房并去掉柱头。

在优选的实施例中，所述小麦孕穗期开始时的小穗指，小麦旗叶叶片全部从倒二叶叶鞘内伸出后，小麦茎部由于小穗生长开始膨大时从小麦中剥离获得的小穗。这个阶段的小麦孕穗刚刚开始发育，此时接种可使小麦矮腥黑粉菌尽早地接触小麦材料，使整个侵染过程的开始节点提前，并最大可能地延长黑粉菌侵染小麦的时间，使最终侵染结果观察效果更好。

在一些实施例中，步骤(2)中，所述确定感染小麦矮腥黑粉菌的小麦采用分子生物学手段进行检测。所述分子生物学手段具体指采用改良的ctab法提取小麦子房dna进行样品检测，参照(gaoetal.，2014)中筛选的基于issr的tck特异性scar分子标记引物(gaoli,yuhuixin,hanwensu,gaofei,liutaiguo,liubo,kangxiaohui,gaojiguo,chenwanquan.developmentofascarmarkerformoleculardetectionanddiagnosisoftilletiacontroversakuhn,thecausalfungusofwheatdwarfbunt)，进行常规pcr扩增，凝胶电泳检测得到一条大小为372bp片段的样品植株可以确定为已发病小麦植株。

在本发明所有的实施例中，所述小麦品种为小麦矮腥黑粉菌易感病品种，优选“冬选三号”。

本发明另一个系列的实施例还提供了上述方法在观察研究小麦矮腥黑粉菌侵染小麦方面的应用，特征是，采用上述任一实施例所述的方法来进行黑粉菌侵染小麦并观察的操作。

下面是本发明最具体的一个实施例，包括如下步骤：

采用易感病品种：“冬选三号”小麦品种约200g使用30％的次氯酸钠溶液消毒1min，消毒后使用蒸馏水冲洗小麦种子三遍，将处理好的种子平摊在直径为15cm的玻璃培养皿中置于温度为4℃、相对湿度为50％的光照培养箱内进行为期一个月低温春化处理，待小麦发芽至芽长1-2cm时备用。

将土壤基质和营养土按3:1的比例混合搅拌均匀后用立式全自动高压灭菌锅灭菌，称取冷却好的混合土壤1.5-2.0kg分装到直径为15cm、深度为20cm的陶瓷花盆中浇水后准备种苗。

将每一粒发芽的小麦种子种植到装有混合土的花盆中，为保证小麦生长所需的养分分配，每盆种7粒发芽的小麦种子为宜。将种下小麦发芽种子的花盆放置在15℃、相对湿度为70％的人工气候生长培养箱(lt-36vlc8，percival)内继续低温春化生长至少2个周，待小麦植株健壮后培养箱参数改为白天25℃、夜间10℃继续培养生长，当小麦生长到孕穗期(最优时期为孕穗期开始时)准备人工接种，人工接种后改为10℃低温培养，接种一周后恢复白天25℃、夜间10℃的设定参数。而现有方法(姚卓、陈万权等，2014《小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发和室内人工接种方法的探索》一文记载)为：将接种后的种子播于直径24cm塑料盆中，深度约5cm，每盆种10粒种子。在10℃下培养，直到幼苗出土良好，时间约2周。然后将幼苗移至高温室中培养，白天温度约25℃，夜间温度约13℃，进行常规管理，将植株种植至成熟。相比上述现有方法，本发明采用的小麦种植步骤能获得符合要求的孕穗期小麦材料，尤其能够获得最佳观察时期的小麦子房状态。

萌发的小麦矮腥黑粉菌人工接种(具体接种步骤详见姚卓、陈万权等，2014《小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发和室内人工接种方法的探索》)一周后，采集小麦孕穗时期的小穗进行分子检测确定发病植株后采样，同时也在对照组的正常小麦中进行采样。采集的小麦穗在体视显微镜(laicas6d)下使用尖嘴镊子(dumont5-antimagetic-e)进行解剖，小心地去掉小麦小穗的外稃、內稃和花药，从盾片上剥离下来子房并去掉柱头。所获得的子房浸入无水乙醇中保存。采用这种方法的好处是：使用尖嘴镊子(dumont5-antimagetic-e)能够很好地在体视显微镜(laicas6d)下操作分离特别微小的小麦子房，避免挤压扎破小麦子房；经过人工分离得到的离体小麦子房可以进行石蜡切片制作和confocal电镜观察，在石蜡切片的制作中可以排除其它穗部组织的挤压；在激光共聚焦显微镜下观察的组织不能太大，只观察离体小麦子房能够排除了小麦穗部其它器官和组织对于激光的干扰，能够更好地操作观察和采集成像。获得的子房将分别用来进行石蜡切片和共聚焦观察。

上述步骤中，所述分子检测指：采用改良的ctab法提取小麦子房dna进行样品检测，参照(gaoetal.，2014)中筛选的基于issr的tck特异性scar分子标记引物(gaoli,yuhuixin,hanwensu,gaofei,liutaiguo,liubo,kangxiaohui,gaojiguo,chenwanquan.developmentofascarmarkerformoleculardetectionanddiagnosisoftilletiacontroversakuhn,thecausalfungusofwheatdwarfbunt)，进行常规pcr扩增，凝胶电泳检测得到一条大小为372bp片段的样品植株可以确定为已发病小麦植株。

石蜡切片的制作：依次将切片放入二甲苯ⅰ20min、二甲苯ⅱ20min、无水乙醇ⅰ10min、无水乙醇ⅱ10min、95％酒精5min、90％酒精5min、80％酒精5min、70％酒精5min处理，再用蒸馏水冲洗。处理过的切片放入1％番红染液染色1-2h。自来水洗去多余染料。再将切片依次分别放入50％、70％、80％梯度酒精脱色各1min。切片入0.5％固绿染液中染色30-60s。无水乙醇i中脱色30s，无水乙醇ii中脱色1min，再将切片放于60°烤箱烤干后在二甲苯中透明5min，最后使用中性树胶封片。

共聚焦的观察：分离的小麦子房先置于10μg/mlpropidiumidodide和0.02％tween20染色20min，再用20μg/mlwga-af488染色20min。最后用1×pbs(ph7.4)冲洗4至6次，最后将染色好的子房保存在pbs溶液中准备观察。现有方法为：分离的小麦子房先置于10μg/mlpropidiumidodide和0.02％tween20染色10min，再用20μg/mlwga-af488染色10min。最后用10×pbs(ph7.4)冲洗3次，最后将染色好的子房保存在pbs溶液中准备观察。(现有方法记载在“蔚慧欣、高利等，2016《小麦矮腥黑粉菌在小麦体内侵染过程的显微观察》一文中)。经实验对比，现有方法与本发明的方法针对同样的小麦品种进行采样、染色、观察获得的图像差别巨大，现有方法并不能满足清楚准确地显示子房内部各细胞的要求，而本发明的方法能够清楚地辨别子房内部的细胞形态和大小，从而便于进一步进行图像的数据统计和分析。

将染色处理好的子房放置在两边用双面贴加高的载玻片中央处，盖玻片贴到双面贴上，避免对于小麦子房的压迫和损伤。将玻片倒置于激光共聚焦显微镜(leica,sp8)下观察小麦矮腥黑粉菌菌丝的侵染过程。其中，设定的参数为wga-af488(gfp)激发蓝光波长488nm，发射光波长分别为550nm和550nm。propidiumidodide激发绿光波长561nm，发射光波长分别为570nm和730nm。

实验例、本发明的方法与现有方法的效果对比

采用蔚慧欣、高利、沈慧敏等，2016《小麦矮腥黑粉菌在小麦体内侵染过程的显微观察》一文中记载的方法，针对正常小麦植株的子房的染色和处理方法进行观察，所得的激光共聚焦成像如图3所示。(图3表示子房直径为600μm的小麦子房confocal图像)所得图像并不能准确而清晰地显示子房内部各部分细胞的轮廓和大小，无法针对图像进行数据统计。

采用本试验的方法针对正常小麦植株的子房的分离、染色和处理方法进行观察，所得的激光共聚焦成像如图4所示。(图4表示子房直径为680μm的小麦子房confocal图像)所得图像能够清楚地辨别子房内部的细胞形态和大小，能够进行图像的数据统计和分析。

经上述对比可知，本发明的方法不仅能准确获得最佳观察时期的小麦穗部子房细胞，并能对其进行有效的染色和清楚的观察，而这些是现有技术中的方法解决不了的，从获得清晰准确的子房细胞这一角度而言，本发明的方法相比现有技术获得了预料不到的技术效果。