本发明属于倍性育种技术领域，具体涉及一种适于枣染色体倍性测定的细胞核悬浮液快速制备方法。
背景技术
枣树（ziziphusjujubamill.）是原产我国的特色优势果树、第一大干果和五大优势经济林之一。但目前枣树品种结构还不够合理，大果、早熟、抗病品种缺乏，亟需加速培育综合性状优良的枣树新品种。在枣树上，由于杂交育种困难，倍性育种成为枣树重要的育种手段。随着枣倍性育种研究的不断深入和成熟应用，快速准确地鉴定试验材料的染色体倍性变得越来越重要和迫切。
传统的倍性鉴定方法主要是染色体显微观察法和形态观察法。染色体显微观察法最直接、最准确，但存在技术步骤繁琐、工作量大、成本高、难以进行大规模快速鉴定等问题。形态观察法主要依据多倍体的“巨大型”特点，但在高倍性时形态表现与倍性并不呈正相关，且表观形态容易受到环境和树体状态等影响，缺乏足够的准确性，一般只宜作为倍性鉴定的辅助方法或初步鉴定方法。鉴于此，建立一种快速、准确、成本低的枣染色体倍性鉴定方法具有重要价值。近年来，流式细胞术以其制样简便、自动化程度高、快速、灵敏并可同时进行多参数检测等优点广泛应用于倍性鉴定中，目前已成为植物倍性鉴定中最常用的技术之一。其原理为：经荧光素染色的细胞核，在一定压力下逐个通过喷嘴，进入流式照射室；经过激光照射，细胞核发射出散射光，最后光信号再转化成电信号，经数据处理输入电脑，呈现出点图和峰图2种流式图谱，峰图纵坐标为粒子数，横坐标为荧光强度，通过计算目标峰的荧光强度从而获得倍性关系。流式细胞术判断染色体倍性的可信度主要取决于以下几个参数：一，峰图，主峰明显，噪音峰较小、背景清晰；二，cv值，动物样品要求cv值低于3%，植物样品cv值低于5%即可。但流式细胞术要求检测样本具备完整的细胞或细胞核悬浮液，若样品中细胞碎片杂质多，导至杂峰碎片较多，使杂峰与信号峰不能良好的分离从而影响结果，则峰值直方图无效。
细胞核悬浮液配制是流式细胞术的关键。其过程一般主要分为三步：一，在合适的裂解液中对样品进行处理，一般为机械破碎；二，对上述得到的液体进行过滤，并与离心相结合除去细胞碎片；三，对所得滤液添加染色剂，即得细胞核悬浮液。但是，在枣上细胞核悬浮液配制还缺乏系统性研究。
本专利发明人以‘临猗梨枣’和其同源四倍体‘辰光’为材料，系统比较了细胞裂解液种类、叶片成熟度、叶片保存时间、染液用量对检测效果的影响。研究发现，3种裂解液（wpb，tris-mgcl2，gpb）均能使‘临猗梨枣’产生信号峰，但wpb裂解液细胞碎片多，不能使‘辰光’产生主峰，裂解效果最差，其他2种裂解液均能使‘辰光’产生清晰的主峰，细胞碎片较少，可以准确的判断出倍性关系。tris-mgcl2与gpb相比较，cv值均低于5%，但在测定四倍体‘辰光’时，利用tris-mgcl2的cv值低于3%，明显优于gpb，且配制方便，成本低廉。因此，tris-mgcl2被选为枣染色体倍性鉴定的最佳裂解液。
为选择适用枣染色体倍性鉴定的最佳叶片状态，对幼嫩、成熟叶片和老化叶片进行了比较。结果显示老化叶片未能产生明显的主峰，幼嫩、成熟叶片均能产生明显的主峰，但前者主峰清晰，背景碎片较少，与杂峰分离度良好且cv值明显优于后者。据此提出适用于枣染色体倍性鉴定的最佳叶片状态为幼嫩叶片。
pi（碘化丙啶）是流式细胞仪倍性鉴定中常用的染色剂，属于非特异性染料，可与碱基进行完美的结合，但pi价格较高且有毒。通过研究不同用量的pi染液对主峰产生的影响，研究提出了适宜的pi染液用量。
在前述研究基础上，形成了本发明专利的枣细胞核悬浮液快速制备方法。利用该方法，细胞核悬浮液配制简单，利用高密度的纱布过滤省去了离心的步骤，操作省时，每个样品处理时间只需5分钟左右（常规方法需要20分钟左右）。经实际检测，本方法适用于所有枣的品种以及酸枣和毛叶枣等枣属植物，1天内可对200余个材料进行倍性鉴定，可满足对大规模样品倍性鉴定的需要。
本发明解决了枣染色体倍性的快速准确鉴定难题，并对其他木本植物的染色体倍性快速鉴定具有参考价值。
技术实现要素：
本发明提供一种适于枣染色体倍性测定的细胞核悬浮液快速制备方法，其能够用于流式细胞术快速鉴定枣染色体倍性，且药品配制简单、成本低、测定效果准确，可大幅度提高鉴定枣染色体倍性的效率。
本发明所采取的技术方案是：采集幼嫩的叶片，迅速切碎，加入预冷的tris-mgcl2裂解液，混匀后静置，用纱布过滤进入离心管中，加入rna酶及pi染液，置于4℃冰箱避光5-30min，即成细胞核悬浮液；然后利用流式细胞仪测定细胞核悬浮液的荧光强度，通过计算目标峰的荧光强度即可获得倍性关系。
本发明的具体内容，即一种适于枣染色体倍性测定的细胞核悬浮液快速制备方法如下：
（1）样品的采集及保存：采集幼嫩的叶片，置于-20~4℃条件下保存；
（2）裂解液配制：取2.422gtris-hcl、0.0813gmgcl2·6h2o于100ml容量瓶中，加入0.5ml的triton-100，用超纯水定容，利用naoh调节ph值至7.0-7.5；
（3）pi染液的配置：取1mgpi染料融于1ml的超纯水或pbs缓冲溶液中，置于-20℃冰箱保存，用时取出解冻，于4℃放置；
（4）细胞核悬浮液的制备：选取幼嫩叶片2~4片，用超纯水清洗1~3次，放入4℃预冷的培养皿中，加入1ml4℃预冷的tris-mgcl2裂解液，用刀迅速切碎叶片，再加入1ml4℃预冷的tris-mgcl2裂解液，混匀后静置1~10分钟，用500目纱布过滤进入离心管中，加入约1μl浓度为10mg/ml的rna酶及10~30μl1mg/ml的pi染液，置于4℃条件下避光染色4~30min，得细胞核悬浮液；
（5）倍性鉴定：细胞核悬浮液用德国partec公司cube8型流式细胞仪测定，通过计算目标峰的荧光强度获得倍性关系。
本发明的有益效果：一是省去了细胞核悬浮液离心的步骤，在保证效果的前提下使流程更简单（处理时间5分钟左右）、成本更低（1元/样品左右）；二是改进了裂解液加入程序；三是确定了pi染液合适用量（10~30μl）。本发明克服了染色体显微观察法步骤操作繁琐、花费高、速度慢及形态观察法准确性低等问题。
具体实施方式
首先配置tris-hcl裂解液，取2.422gtris-hcl、0.0813gmgcl2·6h2o于100ml容量瓶中，加入0.5ml的triton-100，用超纯水定容到100ml，利用naoh调节ph值至7.5，于4℃冰箱中预冷；其次配置pi染液，取1mgpi染料溶于1ml的超纯水，置于-20℃冰箱保存。用时取出解冻，于4℃放置。
于田间选取‘临猗梨枣’及‘辰光’（‘临猗梨枣’的同源四倍体）幼嫩叶片，放入采样袋中，置于冰盒中带回实验室并保存于4℃；取幼嫩叶片50mg，用超纯水冲洗3次，擦干后放入4℃预冷的培养皿中，加入1ml4℃预冷的裂解液，用锋利的刀片快速切碎，再加入1mltris-hcl裂解液，混匀后静置1min；吸取培养皿中的裂解液，用500目滤膜过滤到3ml测试管中，加入20μlpi染液及1μlrnase，混匀后置于4℃冰箱避光染色4min；染色后，利用德国partec公司cube8型流式细胞仪进行检测，收集5000~10000个颗粒，每个样品重复3次；通过计算目标峰的荧光强度获得了倍性关系：辰光/临猗梨枣=1.89±0.15，比值约等于2。