一种百合耐寒评价及耐寒品种的筛选方法及应用与流程

本发明主要涉及百合生理学领域，具体涉及一种百合耐寒评价及耐寒品种的筛选方法及应用，该方法主要通过对百合营养生长期的叶片进行低温处理，通过测量叶片电导率来求出相对电导率拟合logistic回归方程，进而求出百合各个品种的半致死温度(lt50)，对百合品种耐寒性进行评价，并筛选出耐寒性百合品种。

技术背景

百合是百合科(liliaceae)多年生球根花卉植物。通常所说的百合是指百合属(liliumspp.)植物各种及品种的总称。百合花朵硕大、花色艳丽、花姿百态、芳香怡人，作为重要观赏植物既能做切花、盆花，又能在园林绿地中应用，同时有的百合品种可食用和药用，深受广大向消费者喜爱。目前，百合已成为世界五大鲜切花之一，在世界鲜切花市场占有十分重要的地位。近些年，百合培育的新品种越来越多，而中国种植百合的面积也在逐年迅速扩大。但百合在生长过程中对温度要求比较苛刻，高于30摄氏度或低于5摄氏度则会停止生长。在中国中北部地区，冬春季节气温低，虽然大部分生产已经采用日光温室，但由于总体基础薄弱，其光照、温度和可控性较差因此冬春季节低温已成为北方地区百合设施栽培的制约因素。因此，生产中选育耐寒百合进行栽培尤为必要，而选育耐寒百合品种前提需要建立一套评价百合品种耐寒性的技术体系。目前，在百合品种耐寒性筛选上，主要是通过对百合种球和百合组培苗幼苗进行低温处理，通过测定低温胁迫下电导率、mda、pod、保护酶活性等来筛选百合耐寒品种，但这些方法存在一些在弊端，如种球低温处理筛选在筛选过程中每个品种的处理都要消耗大量的种球，品种较多时，更是费时费力；组培苗低温处理对幼苗的生长情况要求高，而且组培苗生长周期长，如果从组培开始，则更是费时费力；此外，对百合种球和组培苗的耐寒评价结果往往与百合植株田间耐寒性存在较大差异。因此，建立一个简单方便且又符合实际生产需要的百合品种的筛选体系是亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一个简单且又符合实际生产所需的百合耐寒品种的筛选方法。首先摘取百合植株生长点以下第二轮第一片叶，清洗干净后横向剪成片段并预处理后放入低温循环仪内处理，隔一天浸提，然后测出煮沸前和煮沸后电导率(即冰冻电导率和煮沸电导率)，求出相对电导率，算出半致死温度(lt50)。根据半致死温度对百合不同品种耐寒性高低进行排序，筛选出抗性强与抗性弱的品种。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的

一种百合耐寒品种的筛选方法，包括以下步骤：

(1)摘取百合植株生长点以下第二轮第一片成熟叶并清洗干净；

(2)将清洗后的成熟叶剪切成叶块，并对叶块进行预处理；

(3)利用低温循环仪对预处理后的叶块进行处理；

(4)将在低温循环仪中处理结束后的样品取出解冻，将解冻后的样品浸提过夜；

(5)测浸提液的冰冻电导率，测完后煮沸并冷却再次测量电导率得到煮沸电导率，根据公式相对电导率＝冰冻电导率/煮沸电导率×100％，求出相对电导率；

(6)用拟合logistic回归方程为：y＝k/(1+ae-bx)对相对电导率进行分析，其中y代表细胞伤害率，x代表处理温度，k为细胞伤害率的饱和容量，a，b为方程参数；为了确定a，b的值，将方程进行线性化处理，ln[(k-y)/y]＝lna-bx，令y＝ln[(k-y)/y]，则转化为细胞伤害率(y)与处理温度(x)的直线方程；通过直线回归的方法求得a，b值及相关系数r²，计算百合品种的半致死温度lt50＝in[(1/a)]/b；

(7)根据半致死温度对百合品种耐寒性进行评价，并筛选出耐寒性百合品种。

步骤(2)中所述预处理的过称为将所述的叶块用湿纱布均匀包裹1层，放入玻璃试管中，置于4℃冰箱过夜。

步骤(3)中利用低温循环仪处理叶块的过程为：在低温循环仪温度降到4℃时，将预处理后的样品放入低温循环仪内处理；所述低温循环仪处理温度为5个梯度0、-3、-6、-9、-12℃；每个梯度处理1h，梯度与梯度之间降温时间为30min。

步骤(4)中将在低温循环仪中处理结束后的样品取出放入4℃冰箱内解冻，将解冻后的样品取出浸提过夜。

步骤(5)中所述煮沸的时间为15min。

步骤(1)中所述的百合植株生长健壮、无病虫害感染。同一百合品种第二轮第一片成熟叶大小一致。

步骤(2)中所述的成熟叶用剪刀横向剪成宽为1cm的小叶块。

步骤(4)中所述的浸提为每个样品中加入30ml蒸馏水进行浸提。

上述的方法在百合耐寒品种筛选中的应用。

本发明所述百合耐寒品种的筛选方法的详细过程包含以下步骤：

(1)摘取百合植株生长点以下第二轮第一片叶，每个品种取得10片大小一致的叶片，用自来水和蒸馏水各清洗三遍，再用吸水纸将叶片上的水吸干。

(2)将步骤(1)中的叶片用剪刀横向剪成宽为1cm的小叶块，然后每2片叶为一份，用湿纱布均匀包裹一层，放入25mm×150mm的玻璃试管中，放进4℃冰箱一夜，第二天待用。

(3)把步骤(2)中的样取出，平行排在试管架上并用橡皮筋绑紧，然后等低温循环仪温度降到4℃时，将其放入低温循环仪内处理。处理温度为5个梯度0℃、-3℃、-6℃、-9℃、-12℃。每个梯度处理1h，梯度与梯度之间降温时间为30min。然后把样取出后放入4℃冰箱内解冻，到第二天再取出来使用。

(4)把步骤3)解冻后的样取出开始浸提，每个试管中的样均分三份分别放到试管中，每个中加入30ml蒸馏水，浸提过夜。

(5)把步骤4)浸提过后的样开始测电导率。测完后煮沸15min，等冷凉后再次测量电导率。然后根据公式i求出其性对电导率：

相对电导率(rec，％)＝冰冻电导率/煮沸电导率×100％(i)

(6)耐寒研究中，相对电导率拟合logistic回归方程为：y＝k/(1+ae-bx)。其中y代表细胞伤害率，x代表处理温度，k为细胞伤害率的饱和容量，a、b为方程参数。为了确定a，b的值，将方程进行线性化处理，ln[(k—y)/y]＝lna-bx，令y1＝in[(k—y)/y]，则转化为细胞伤害率(y1)与处理温度(x)的直线方程。通过直线回归的方法求得a，b值及相关系数r²(拟合度)，用方程ii求出半致死温度。

lt50＝in[(1/a)]/b(ii)

(7)根据半致死温度对百合不同品种耐寒性高低进行排序，筛选出抗性强与抗性弱的品种。

本发明的有益效果：

本发明针对百合耐寒性品种的筛选提供了一个有效方便的方法，为以后耐寒品种的选育以及研究奠定一定的基础。同时也具有以下的重要特征1)在百合营养生长过程中对百合叶片低温处理，更贴近实际生产。2)多种筛选方法相结合，递进筛选，既科学又便捷。

附图说明

图1为‘特拉索橙’相对电导率拟合度曲线；

图2为‘木门’相对电导率拟合度曲线；

图3为‘黑幕’相对电导率拟合度曲线。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步的详细说明。

本发明运用叶片低温处理对30个切花品种进行实验筛选(表1)。

表1实验材料的品系及种球规格

实验材料种植在南京农业大学菊花基地玻璃温室中，于2016年10月底开始开展实验，具体实施实例如下：

1.1摘取百合植株生长点以下第二轮第一片成熟叶，每个品种取10片大小一致的叶片，用自来水和蒸馏水各清洗三遍，再用吸水纸将叶片上的水吸干，然后用剪刀把叶片横向剪成宽为1cm的小叶块，然后每2片叶为一份，分成5份，用湿纱布均匀包裹一层，放入25mm×150mm的玻璃试管中，放进4℃冰箱一夜，第二天把样取出，平行排在试管架上并用橡皮筋绑紧，然后等低温循环仪温度降到4℃时，将其放入低温循环仪内处理，仪器是polyscience公司的的pp28-r30低温循环仪。处理温度为5个梯度0℃、-3℃、-6℃、-9℃、-12℃、。每个梯度处理1h，梯度与梯度之间降温时间为30min。每个样取出后放入4℃冰箱内解冻，到第二天再取出来使用。解冻后的样取出开始浸提，把每个试管中的样均分3份(3个重复)分别放到试管中，每个中加入30ml蒸馏水，浸提过夜。浸提过后的样开始测电导率，测完后煮沸15min，等冷凉后再次测量电导率。相对电导率(rec，％)＝冰冻电导率/煮沸电导率×100％，从而求出其相对电导率。

1.2数据处理

相对电导率拟合logistic回归方程为：

y＝k/(1+ae-bx)

半致死温度(lt50)

lt50＝in[(1/a)]/b

y代表细胞伤害率，x代表处理温度，k为细胞伤害率的饱和容量，a、b为方程参数。

1.3结果分析

1.3.1细胞膜与耐寒性

电解质渗漏测定结果表明：30份材料电解质渗漏程度随着处理温度的下降而增大，因此相对电导率也随着温度下降而上升，且相对电导率曲线明显呈s型(图1～3)，图中的5个点对应的温度分别是0、-3、-6、-9、-12℃。从图中可以明显看到‘特拉索橙’和‘黑幕’在0℃到-9℃之间，相对电导率呈明显上升趋势，在-9℃到-12℃度之间基本不再上升并趋于稳定趋势；‘特拉索橙’在-3℃和-7℃之间相对电导率陡然上升，‘黑幕’在-4℃到-8℃之间相对电导率陡然上升，说明这2个品种在这对应的温度里伤害最大。s型拐点就是它们分别对应的半致死温度。‘木门’所对应的曲线在0℃到-12℃，基本是呈上升趋势，在0℃到-5℃之间缓慢上升，在-6℃到-10℃之间呈快速上升趋势，在-10℃之后才开始有放缓趋势，它的s型拐点则在-6℃和-10℃之间。

1.3.2半致死温度(lt50)比较分析

30个百合品种在不同的低温处理下，根据相对电导率所得到的拟合回归方程、拟合度及半致死温度见表3，按照半致死温度升序排列。30个百合品种叶片电解质外渗法耐寒性试验结果表明，实验材料的电解质渗出率随着温度的降低而升高，并且所以的品种相对电导率的拟合曲线都成明显的s型，且拟合度较好，这说明实验设计的温度梯度是合理的。lt50作为植物耐寒性评价指标，lt50越低耐寒性越强，反之，则越弱。从表3可以看出，30份实验材料的半致死温度在-5℃和-9℃之间，这说明这些百合品种耐寒性相对较弱。其中抗性比较弱的品种有‘特拉索橙’、‘卡斯太白’、‘耶罗林’、‘小罗宾’，但也有几个品种相对耐寒性较强如‘木门’、‘红衣主教’(表2，表3)。

表230个百合品种logistic方程和r²

表330个百合品种lt50

由以上实例可以看出：30个百合品种叶片经过低温处理后，电导率也随着温度下降而上升，且相对电导率曲线明显呈s型，拟合度都比较高，每个品种的半致死温度都很容易求出，进而判断出其耐寒性强弱。这中筛选百合耐寒品种的方法与其他筛选方法相比更简单更易操作，尤其是对多个品种进行筛选时，更能体现这一方法的优越性。同时，这一方法比其他方法更贴合实际，是在百合植株生长期进行筛选，而其他方法要么是对百合鳞茎或组培苗处理来筛选，则与实际栽培表现出来的还相差较远。因此，本方法对百合耐寒性评价结果更能反应百合田间的实际耐寒性，比传统方法更具代表性。上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。