一种血液及组织中甲酸浓度的检测方法与流程

本发明属于生物化学检测领域，具体涉及一种血液及组织中甲酸浓度的检测方法。

背景技术：

高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，hplc),又称为“高压液相色谱”，是色谱法的一个重要分支。其以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。经典的液相色谱法，其流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送，具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。目前，高效液相色谱法已成为化学、医学、工业、农学、食品等学科领域中重要的分离、分析技术。

国外学者有应用顶空气相色谱法分析尸体血液中甲酸的报道，但该方法并未经过验证。目前国内仅对血液和尿液中甲酸浓度的检测有报道，尚未见有关于组织中甲酸检测方法的研究。morris曾采用hplc的方法在210nm吸收波长下检测到了溶液中的甲酸。与血液不同，肝肾等致密组织中的甲酸分散在组织内部，普通的物理学方法很难将其完全释放出来，故给组织中甲酸浓度的检测带来了一定的难度，给司法鉴定人的鉴定工作造成一定障碍。mp*fastprep-24样品处理系统(核酸提取仪、均质器，美国)，可以高效、快速、稳定地破碎各种类型样本制成组织匀浆，避免了研磨、匀浆、超声波处理等传统方法的费力、耗时、低效等诸多缺点，且fastprep-24系统的样品裂解在40秒内完成，且不产生热量，几乎对核酸和蛋白质的无破坏作用，可以最大限度的避免核酸的降解和蛋白的解离，目前已广泛应用于提取蛋白/核酸以及充分混匀样品组织等前期处理。我们在了解了mp*fastprep-24样品处理系统的特点后，考虑可借鉴该系统对含有甲酸的组织进行前处理应可充分释放组织中的甲酸。我们首次采用该处理系统的方法，将肝肾等组织中的甲酸释放出来，是进行甲酸检测的创新性之一。在通过对样本进行前处理后，对hplc的仪器参数进行了重新调整和设置，采用hplc方法对大鼠血液及肝肾等组织中甲酸的浓度进行了成功检测，结果可靠稳定。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种血液及组织中甲酸浓度的检测方法。

本发明的技术方案如下：

(1)对大鼠进行甲醇灌胃染毒，同时提取甲醇中毒3天组和7天组的血、肝、肾、脑和胃组织；

(2)采用mp*fastprep-24样品处理系统(mpbiomedicals,llc,solon,oh,usa)处理组织，配合磁珠强大的振动作用，最大限度地将甲酸从心、肝、肾、脑和胃组织样本中提取出来，其中振荡速度设置为4.5m/s，时间为2-3min；

(3)将步骤(2)中获得的样本放在离心机中，10000rpm，离心10min；

(4)取20μl步骤(3)获得的上清液进样hplc检测；所述hplc检测采用thermou3000hplc仪(thermofisherscientificinc.,waltham,ma,usa)，色谱柱为calesilods-100c18column(5um,4.6×250mm)，进样20μl，流速控制在1ml/min,流动相为甲醇与超纯水的混合物，二极管阵列检测器(diodearraydetector，dad)，温度设置为周围环境；在检测甲酸浓度前，拟检测波长设置为215nm；在空白溶剂中添加甲酸，以确定甲酸色谱峰的保留时间；为绘制标准曲线，一系列已知浓度的甲酸标准品溶液与流动相按照相同比例混合进样检测。

其中，所述步骤(4)中甲醇与超纯水的比例优选为6：4。

本发明的有益效果是：

首次采用mp*fastprep-24样品处理系统结合hplc方法，将肝肾等组织中的甲酸释放出来，是进行甲酸检测的创新性之一。本方法中，在通过对样本进行前处理后，对hplc的仪器参数进行了重新调整和设置，采用hplc方法对大鼠血液及肝肾等组织中甲酸的浓度进行了成功检测，结果可靠稳定。本发明方法对司法工作实践具有重要意义。

附图说明

图1：甲酸标准品的色谱峰。

图2：甲酸的标准曲线。

图3：各组血液中甲酸的色谱峰，其中a为对照组，b为中毒3天组，c为中毒7天组与甲酸标准品比较，中毒3天组和7天组均能检测到甲酸色谱峰。

具体实施方式

实施例1

1、样本前处理方法

对大鼠进行甲醇灌胃染毒，同时提取甲醇中毒3天组和7天组的血、肝、肾、脑和胃等组织检测其中的甲酸浓度。

采用mp*fastprep-24样品处理系统(mpbiomedicals,llc,solon,oh,usa)处理组织，配合磁珠强大的振动作用，最大限度地将甲酸从心、肝、肾、脑和胃等组织中提取出来。振荡速度设置为4.5m/s，时间约为2-3min。将样本放在离心机中，10000rpm，离心10min。取20μl上清液进样检测。

2、hplc检测

采用thermou3000hplc仪(thermofisherscientificinc.,waltham,ma,usa)，色谱柱为calesilods-100c18column(5um,4.6×250mm)，进样20μl，流速控制在1ml/min,流动相为甲醇与超纯水的混合物(甲醇/超纯水＝6：4)，二极管阵列检测器(diodearraydetector，dad)，温度设置为周围环境。在检测甲酸浓度前，拟检测波长设置为215nm。在空白溶剂中添加甲酸，以确定甲酸色谱峰的保留时间。为绘制标准曲线，一系列已知浓度的甲酸标准品溶液与流动相按照相同比例混合进样检测。

3、测量结果

(1)甲酸色谱峰与标准曲线

采用甲酸标准品溶液进行检测，发现甲酸色谱峰的保留时间出现在1.977-2.07min(图1)。根据甲酸标准品浓度与其色谱峰面绘制的标准曲线，y＝15.837x–6.6471；r2＝0.992，其中纵坐标为甲酸浓度，横坐标为检测器所检测的甲酸峰面积(图2)。

(2)甲酸浓度

血液中甲酸的浓度检测结果如图3所示，发现在甲酸保留时间点出现未知峰，通过与甲酸标准品进行比对，确定该未知峰为甲酸色谱峰。基于甲酸浓度标准曲线，得到血液及肝肾等组织中的甲酸浓度，见表1。结果显示，相较于血液而言，甲酸在组织中的浓度略高。与3天组比较发现，中毒7天组的脑和胃组织内的甲酸浓度有一定的增加，而肝和肾组织中的甲酸浓度反而有所下降。

表1血液及其他组织中甲酸浓度

n＝10，x±s，a为对照组，b为中毒3天组，c为中毒7天组。

(3)甲酸在血液及肝肾等组织中的分布如表1所示。