基于光激发扫描探针的细胞电生理探测方法、装置和系统与流程

本发明实施例涉及生物电探测技术领域，尤其涉及一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测方法、装置和系统。

背景技术：

生物电在植物生长生命活动中发挥重要作用，电信号对植物的许多生理活动都会产生重要影响，细胞间通过电信号传导信息是植物信息传导的基本方式之一。科学家在生物电产生机制的研究中发现了细胞生物膜对离子通透性的变化。离子通道由细胞产生的特殊蛋白质构成，它们聚集起来并镶嵌在细胞膜上。离子通道的活性对实现细胞各种功能具有重要意义。细胞膜上离子通道的功能，除了可以调节细胞内外的渗透压，也是维持细胞膜电位的重要分子，而细胞要进行电讯号传导，便是靠离子的进出以造成膜电位的变化。激光作用可显著影响视蛋白光敏离子通道稳态激活和失活过程。弱光作用光敏离子通道细胞膜可以改变电压门控离子通道特性，从而影响动作电位的形成和发放，调节生理功能。目前对光敏离子通道的探测方法尚缺乏，能同时获取细胞膜光激发生物电信号和细胞膜蛋白高精度结构的技术手段尚不足。

传统研究细胞膜电特性和离子通道性能的方法包括：膜片钳技术、通道蛋白分离纯化等生化技术、人工膜离子通道重建技术及一些物理和化学技术。应用膜片钳技术可以直接观察和分辨光敏离子通道或光色素调控离子通道电流及其开闭时程，但是无法实时探测细胞膜纳米结构形貌，不能同时获取细胞膜纳米尺度的结构信息和电特性。

技术实现要素：

本发明提供一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测方法、装置和系统，以实现在样品表面探测纳米尺度形貌的同时，实时获取细胞膜离子通道光激发电信号。

第一方面，本发明实施例提供了一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测方法，该方法包括：

驱动扫描探针的导电针尖与位于样品基底之上的细胞膜样品接触，采用激光光源激发所述细胞膜样品，使得所述细胞膜样品获得光电特性响应；

通过所述导电针尖对所述细胞膜样品外加激励电信号；

采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在光激发和外加激励电信号下的离子通道形貌和光电响应电信号。

优选地，采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在光激发和外加激励电信号下的离子通道形貌和电信号具体包括：采用所述扫描探针扫描探测所述细胞膜样品在光激发条件下的离子通道形貌，采用所述扫描探针探测所述细胞膜样品在光激发条件下的离子通道的光电响应电信号；

采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在光激发和外加激励电信号下的离子通道形貌和光电响应电信号之后，还包括：根据离子通道形貌生成细胞膜样品的离子通道形貌图，根据各离子通道的光电响应电信号生成细胞膜样品的光电响应电信号分布图。

优选地，采用激光光源激发所述细胞膜样品具体包括：调控激光光源的激光波长和强度，采用不同波长和不同强度的激光激发所述细胞膜样品；采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在光激发和外加激励电信号下的离子通道形貌和光电响应电信号具体包括：采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在不同波长和不同强度的激光激发下的离子通道形貌和光电响应电信号。

优选地，采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在光激发和外加激励电信号下的离子通道形貌和光电响应电信号之后，还包括：

根据所述细胞膜样品的离子通道形貌和光电响应电信号，驱动所述导电针尖定位于细胞膜样品的离子通道定点，改变所述激光光源的波长和/或强度，采用扫描探针记录细胞膜样品的离子通道定点在不同的波长和/或强度的激光激发下的局域光电响应电信号变化。

优选地，采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在光激发和外加激励电信号下的离子通道形貌和光电响应电信号之后，还包括：

改变细胞膜样品环境，探测细胞膜样品在不同环境条件下的光电响应电信号变化，生成不同环境条件下的离子通道形貌图像和光电响应电信号图像；或

根据所述细胞膜样品的离子通道形貌和光电响应电信号，驱动所述导电针尖定位于细胞膜样品的单个离子通道，改变细胞膜样品环境，采用扫描探针观测细胞膜样品的单个离子通道在不同环境条件下的光电响应电信号变化。

第二方面，本发明实施例还提供了一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测装置，该装置包括：

扫描探针驱动模块，用于驱动扫描探针的导电针尖与位于样品基底之上的细胞膜样品接触；

光激发执行模块，用于采用激光光源激发所述细胞膜样品，使得所述细胞膜样品获得光电特性响应；

外加电信号执行模块，用于通过所述导电针尖对所述细胞膜样品外加激励电信号；

形貌和光电响应电信号记录执行模块，用于采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在光激发下的离子通道形貌和光电响应电信号。

优选地，所述光激发执行模块具体用于：调控激光光源的激光波长和强度，采用不同波长和强度的激光激发细胞膜样品；所述形貌和电信号记录执行模块具体用于：采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在不同波长和强度的激光激发下的离子通道形貌和光电响应电信号。

优选地，该装置还包括：定点电信号记录执行模块，用于根据所述细胞膜样品的离子通道形貌和光电响应电信号，驱动所述导电针尖定位于细胞膜样品的离子通道定点，改变所述激光光源的波长和/或强度，采用扫描探针记录细胞膜样品的离子通道定点在不同的波长和/或强度的激光激发下的局域光电响应电信号变化。第三方面，本发明实施例还提供了一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测系统，包括扫描探针，还包括激光光源和第二方面所述的装置，所述装置分别连接所述扫描探针和激光光源，所述扫描探针的导电针尖位于激光光源发射的激光的中心。

优选地，该系统还包括样品室，所述细胞膜样品、扫描探针与样品基底均位于所述样品室，所述样品室与水气泵相连，所述水气泵可将水蒸气泵入样品室；所述样品室内设置有控温元件。

本发明提供的基于光激发扫描探针的生理探测细胞膜电特性和离子通道的方法、装置和系统，可以直接在样品表面探测纳米尺度形貌的同时，实时获取细胞膜的通道电流及电学特性，并且不破坏样品结构和性质。

附图说明

图1是本发明实施例一中的一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测方法流程图；

图2是本发明实施例二中的一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测方法流程图；

图3是本发明实施例三中的一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测方法流程图；

图4是本发明实施例四中的一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测装置结构示意图；

图5是本发明实施例五中的一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测装置结构示意图；

图6是本发明实施例六中的一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测装置结构示意图；

图7是本发明实施例七中的一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测系统结构示意图；

图8是本发明实施例七中的另一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测系统结构示意图；

图9是本发明实施例七中的另一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测系统结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部结构。

实施例一

图1为本发明实施例一提供的一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测方法的流程图，本实施例可适用于细胞电特性和离子通道探测的情况，例如，水稻叶片细胞电学特性和离子通道探测，农作物/植物光敏色素对细胞离子通道和质子泵的调控机制，视蛋白光敏离子通道，表达有视蛋白的神经元细胞能被特异性地激活，研究神经元细胞之间信息交流机制，绘制神经网络等，该方法可以由基于光激发扫描探针的细胞电生理探测装置来执行，该装置可以由硬件和/或软件来实现，例如可以为集成在扫描探针显微系统的控制部件或控制程序。如图1所示，该方法包括：

步骤s110、驱动扫描探针的导电针尖与位于样品基底之上的细胞膜样品接触。

其中，细胞膜样品位于样品基底之上，扫描探针位于细胞膜上方，驱动扫描探针的导电针尖与细胞膜样品的与样品基底相对的一侧接触。

步骤s120、采用激光光源激发所述细胞膜样品，使得所述细胞膜样品获得光电特性响应。

其中，采用激光光源激发所述细胞膜样品，使得所述细胞膜样品获得光电特性响应，细胞膜样品的离子通道通的打开/闭合程度发生改变，离子通道形貌和电信号发生变化。

采用激光光源激发所述细胞膜样品具体包括：采用激光激发样品一定时间。不同细胞样品获得光电特性响应的时间受激光激发时间的影响，不同细胞膜样品的离子通道打开所需要的激光激发时间不一样，跟细胞膜样品的光敏性能有关，有的对光激发很敏感，有的不太敏感。例如，细菌视紫红质细胞膜只需要几秒钟。本领域技术人员可以根据需要选择激光激发的时间，本发明对激光激发时间不作具体限定。

步骤s130、通过所述导电针尖对所述细胞膜样品外加激励电信号；

步骤s130、采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在光激发和外加激励电信号下的离子通道形貌和光电响应电信号。

其中，采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在光激发和外加激励电信号下的离子通道形貌和电信号具体包括：采用所述扫描探针扫描探测所述细胞膜样品在光激发下的离子通道形貌，采用所述扫描探针探测所述细胞膜样品在光激发下的离子通道电信号。

此外，为了能更准确地记录离子通道的电信号，还可以将离子通道的电信号通过前置放大器放大再进行记录。

优选地，采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在光激发下的离子通道形貌和电信号之后，还包括：根据离子通道形貌生成细胞膜样品的离子通道形貌图，根据各离子通道电信号生成细胞膜样品的电信号分布图。

需要指出的是，步骤s110和步骤s120的顺序可以对调，并不影响本发明的结果。

在上述技术方案的基础上，采用激光光源激发所述细胞膜样品具体包括：调控激光光源的激光波长和强度，采用不同波长和不同强度的激光激发所述细胞膜样品；所述采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品的离子通道形貌和电信号具体包括：采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在不同波长和不同强度的激光激发下的离子通道形貌和电信号。

因为不同光敏蛋白具有不同的光色敏感性，有的对蓝光敏感，有的对绿光敏感，有的对红光敏感。例如，视锥细胞中的视蛋白根据其吸收光谱范围的不同可进一步分为长波长视蛋白、中波长视蛋白、短波长视蛋白等。l型视锥细胞、m型视锥细胞和s型视锥细胞的敏感峰值分别为565nm、535nm和440nm。对他们进行探测时，波长分别选择为敏感峰值，即565nm、535nm和440nm。激光强度可从1mw到100mw可调节，根据光激发电流的大小适当调节光强。

采用不同波长和不同强度的激光激发所述细胞膜样品的好处是可以探测各种不同的光敏蛋白，可以探测不同蛋白相对应的光敏电流和光敏特性。本领域技术人员可以根据需要选择激光的波长和强度，本发明对激光的波长和强度不作具体限定。

本实施例的基于光激发扫描探针的细胞电生理探测方法，能同时探测细胞膜离子通道电特性和离子通道纳米尺度三维形貌，并且不破坏样品结构和性质。

实施例二

请参考图2，图2是本发明实施例二提供的一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测方法的流程图。本实施例以上述实施例方案为基础，进行了优化改进，特别是提供了定点探测的具体方案。如图2所示，该方法包括：

步骤s210、驱动扫描探针的导电针尖与位于样品基底之上的细胞膜样品接触。

步骤s220、采用激光光源激发所述细胞膜样品，使得所述细胞膜样品获得光电特性响应。

步骤s230、通过所述导电针尖对所述细胞膜样品外加激励电信号。

步骤s240、采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在光激发和外加激励电信号下的离子通道形貌和电信号。

步骤s250、根据所述细胞膜样品的离子通道形貌和光电响应电信号，驱动所述导电针尖定位于细胞膜样品的离子通道定点，改变所述激光光源的波长和/或强度，采用扫描探针记录细胞膜样品的离子通道定点在不同的波长和/或强度的激光激发下的局域光电响应电信号变化。

其中，驱动所述导电针尖定位于细胞膜样品的离子通道定点，改变所述激光光源的波长和/或强度，采用扫描探针探测细胞膜样品的离子通道定点在不同的波长和/或强度的激光激发下的局域电信号，从而根据在不同的波长和/或强度的激光激发下的局域电信号，获得细胞膜样品的离子通道电特性曲线。

本实施例采用的是接触式扫描和定点探测相结合的探测模式。接触式扫描，利用导电针尖扫描探测细胞膜样品离子通道形貌和电信号；定点探测，根据离子通道形貌和电信号，利用针尖定位于扫描的样品中的离子通道定点，对离子通道的局域电流进行测量和成像。从而可以直接在样品表面探测纳米尺度形貌的同时，实时获取细胞膜的通道电流及电学特性，并且不破坏样品结构和性质。

实施例三

请参考图3，图3是本发明实施例三提供的一种基于扫描探针的细胞电生理探测方法的流程图。本实施例以上述实施例方案为基础，进行了优化改进，特别是提供了改变样品环境进行扫描探测或定点探测的具体方案。如图3所示，该方法包括：

步骤s310、驱动扫描探针的导电针尖与位于样品基底之上的细胞膜样品接触。

步骤s320、采用激光光源激发所述细胞膜样品，使得所述细胞膜样品获得光电特性响应。

步骤s330、通过所述导电针尖对所述细胞膜样品外加激励电信号。

步骤s340、采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在光激发下的离子通道形貌和光电响应电信号。

步骤s350、改变细胞膜样品环境，探测细胞膜样品在不同环境条件下的光电响应电信号变化，生成不同环境条件下的离子通道形貌图像和光电响应电信号图像；或

根据所述细胞膜样品的离子通道形貌和光电响应电信号，驱动所述导电针尖定位于细胞膜样品的单个离子通道，改变细胞膜样品环境，采用扫描探针观测细胞膜样品的单个离子通道在不同环境条件下的光电响应电信号变化。

其中，改变细胞膜样品环境包括药物、湿度、或温度等，一方面，通过导电针尖扫描探测细胞膜样品在不同环境条件下的光电响应电信号变化，生成不同环境条件下的离子通道形貌图像和光电响应电信号图像，此时获得的是细胞膜样品整体或某个区域的离子通道形貌图像和光电响应电信号图像；另一方面，驱动所述导电针尖定位于细胞膜样品的单个离子通道，以观测单个离子通道在不同环境条件下的光电响应电信号变化，此时获得的是细胞膜样品单个离子通道光电响应电信号变化。

通过各离子通道开放的电信号，可直接得到各离子通道开放的电信号幅值分布、开放几率、和开放寿命分布等功能参量，在此基础上还可以并分析功能参量与膜电位、离子浓度等之间的关系。

本实施例采用的是接触式扫描和定点探测相结合的探测模式，可以直接在样品表面探测纳米尺度形貌的同时，实时获取细胞膜的通道电流及电学特性，并且不破坏样品结构和性质。

以下是本发明具体实施方式中提供的一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测装置的实施例，装置的实施例基于上述的方法的实施例实现，在装置中未尽的描述，请参考前述方法的实施例。

实施例四

请参考图4，图4是本发明第四实施例提供的一种基于光激发扫描探针的细胞电生理探测装置的结构示意图。如图4所示，该装置1包括：

扫描探针驱动模块101，用于驱动扫描探针的导电针尖与位于样品基底之上的细胞膜样品接触；

光激发执行模块102，用于采用激光光源激发所述细胞膜样品，使得使得所述细胞膜样品获得光电特性响应；

外加电信号执行模块103，用于通过所述导电针尖对所述细胞膜样品外加激励电信号；

形貌和光电响应电信号记录执行模块104，用于采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在光激发下的离子通道形貌和电信号。

进一步地，所述光激发执行模块102具体用于：调控激光光源的激光波长和强度，采用不同波长和强度的激光激发细胞膜样品；所述形貌和光电响应电信号记录执行模块104具体用于：采用所述扫描探针记录所述细胞膜样品在不同波长和强度的激光激发下的离子通道形貌和电信号。

本实施例各模块之间相互联系实现接触式扫描探测，可以直接在样品表面探测纳米尺度形貌的同时，实时获取细胞膜的通道电流及电学特性，并且不破坏样品结构和性质。

实施例五

实施例五以实施例四的方案为基础，进行了优化改进，特别是提供了定点探测的方案，与实施例四不同之处仅在于多了定点形貌和电信号记录执行模块104。如图5所示，该装置1还包括：

定点电信号记录执行模块105，用于根据所述细胞膜样品的离子通道形貌和光电响应电信号，驱动所述导电针尖定位于细胞膜样品的离子通道定点，改变所述激光光源的波长和/或强度，采用扫描探针记录细胞膜样品的离子通道定点在不同的波长和/或强度的激光激发下的局域光电响应电信号变化。

实施例六

实施例六以实施例四或五的方案为基础，进行了优化改进，特别是提供了改变样品环境进行扫描探测或定点探测的方案，不同之处仅在于多了单个环境控制下的信号探测模块106。如图6所示，该装置1还包括：

环境控制下的信号探测模块106，用于：

改变细胞膜样品环境，探测细胞膜样品在不同环境条件下的光电响应电信号变化，生成不同环境条件下的离子通道形貌图像和光电响应电信号图像；或

根据所述细胞膜样品的离子通道形貌和光电响应电信号，驱动所述导电针尖定位于细胞膜样品的单个离子通道，改变细胞膜样品环境，采用扫描探针观测细胞膜样品的单个离子通道在不同环境条件下的光电响应电信号变化。

实施例五和六的各模块之间相互联系实现接触式扫描和定点探测相结合的探测模式，可以直接在样品表面探测纳米尺度形貌的同时，实时获取细胞膜的通道电流及电学特性，并且不破坏样品结构和性质。

实施例七

请参考图7-9，图7-9是本发明第七实施例提供的一种光激发基于扫描探针的细胞电生理探测系统的结构示意图。如图7和图9所示，该系统包括：上述实施例四-六任一所述的装置1、扫描探针2、和激光光源3，所述装置1分别连接所述扫描探针2和激光光源3，所述扫描探针2的导电针尖位于激光光源3发射的激光的中心。

具体的，所述扫描探针1的控制端连接所述装置1，所述扫描探针1在所述装置1的驱动下移动，与细胞膜样品接触，扫描记录探测细胞膜样品在光激发下的离子通道形貌和电信号。

扫描探针的针尖为导电探针，本体结构为二氧化硅或氮化硅材料，针尖涂覆导电层，导电层为金膜、铬、钛、铂铱复合薄膜等。

激光光源3包括激光波长和光强度可调节的激光发生器和直角三角棱镜。激光从激光发生器水平出射，通过三角棱镜反射转向90度竖直向上射向细胞膜样品6。所述激光光源3的激光发生器的控制端连接所述装置1。所述激光光源3用于激发细胞膜样品的光电特性响应。所述激光光源3在所述装置1的控制下打开或关闭，调整激光波长和强度。为了能够使激光竖直向上射向细胞膜样品6，放置所述细胞膜样品6的样品基底7为透光石墨基底。

在上述实施例的技术方案的基础上，如图8和图9所示，所述系统还包括水气泵4、控温元件5和样品室8，所述扫描探针2、细胞膜样品6、与样品基底7均位于所述样品室8，所述样品室8与水气泵4相连，所述水气泵4可将水蒸气泵入所述样品室8；所述样品室8内设置有控温元件5。水气泵4和控温元件5的控制端分别连接所述装置1，在所述装置1的驱动下改变细胞样品环境。

具体的，所述样品室8为带水汽出口和水汽入口的密封装置，水汽入口与水气泵4相连，水气泵4可将水蒸气泵入样品室8中调节湿度，保持待测细胞膜的生物活性。控温元件5为半导体制冷元件，控制样品温度保持在10度以下的低温环境中，保持待测生物膜的生物活性。

上述产品可执行本发明任意实施例所提供的方法，具备执行方法相应的功能模块和有益效果。

注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。