一种细胞内MicroRNA的检测探针及合成方法和检测方法及试剂盒与流程

本发明属于生物检测领域，更具体地，涉及一种细胞内microrna的检测探针及合成方法和检测方法及试剂盒。

背景技术：

小分子核糖核酸(microrna)是指一系列小的非编码的18～25个碱基的核糖核酸，它在包括人类绝大多数真核生物中表达，是控制基因表达的关键因素之一。并且成为了诊断中潜在的生物标志物和治疗中的目标。细胞内的microrna表达水平非常低，并且体内的环境非常复杂，实现活细胞内的microrna原位监控和追踪一直面临着挑战。目前，有很多基于酶辅助循环扩增的信号放大方法被开发出来了，包括双链特异性核酸酶(dsn)循环扩增，茎环辅助等温扩增(lamp)，基于exoiii的循环扩增，滚环扩增(rca)，发夹辅助二次酶扩增(hdea)。这些信号放大方法实现了多个信号输出的目的(靶标和信号探针比例为1:n，甚至1:n²)，能够检测从细胞、尿液或组织样品中提取的微量microrna。然而，大多数方法需要复杂而精细的探针设计过程，得不到广泛地应用。更重要的是，目前很多检测策略中使用的探针都需要修饰荧光团和淬灭团，不仅带来了化学合成步骤多的工作，而且需要精确设计荧光团和淬灭团之间的距离，从而也限制了在体内microrna追踪中的应用。在上述方法中，荧光素作为信号输出，存在一个重要的问题，光漂白现象很严重，尤其在激光共聚焦观察过程中，不利于活细胞内长时间的观察。因此，迫切需要开发一种设计简单和抗光漂白能力强的探针，来用于活细胞内microrna原位成像。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种细胞内microrna的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制转染液：转染液由a、b液组成，a液中包括脂质体2000(10μl)和opti-mem(140μl)培养基；b液包括dna外切酶iii(1.33u/μl)、探针分子(6.6u/μl)、opti-mem培养基，总体积是150μl；将混匀的a液和b液进行充分混合。脂质体2000的作用是增加了细胞的通透性，有助于将核酸转染进入真核细胞。

(2)待检测细胞的培养：当mcf-7癌细胞长到瓶底的80％时,将细胞消化后,接种4×10⁴个细胞于激光共聚焦培养皿中,加入培养基0.5ml，放入培养箱中培养24小时。

(3)将激光共聚焦培养皿中培养基去掉，加入1mlopti-mem培养基，培养2h后，去掉opti-mem培养基，将步骤(1)中的转染液加入到步骤(2)中所得的待检测细胞中，于37℃温度下转染1小时；使所述转染液中的探针分子充分转染进待检测细胞中；

(4)将步骤(3)的反应液去掉转染液，用缓冲液冲洗三次后，放入适量的pbs，用激光共聚焦显微镜对细胞荧光成像，即得到所述待测细胞内microrna的检测结果。

优选地，所述诱导发光化合物为(e)-1-(4-叠氮基丁基)-4-(4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯乙烯基)吡啶-1-六氟磷酸盐(v)，结构式如式i所示：

优选地，所述步骤(1)转染液中探针分子的浓度为0.03-0.04μm/μl；

dna外切酶iii的浓度为1.3-1.4u/μl；脂质体2000的浓度为0.03-0.04μl/μl。

由于该分子在发射波长为515nm～615nm时荧光效果最为明显，所以检测方法中荧光检测的发射波长优选为515nm～615nm。

优选地，检测方法中所述激发波长400-410nm，。

所述的探针分子的结构式如式ⅱ所示:

该探针分子简写为tpe-py-ldna探针。

按照本发明的另一方面，提供了一种用于细胞内microrna检测的探针分子，所述探针分子的结构式如式ⅱ所示:

按照本发明的另一方面，提供了一种细胞内microrna检测的探针分子的合成方法，合成路线如下：

按照本发明的另一方面，提供了一种检测细胞内microrna的试剂盒，其特征在于，包含式ⅱ所述的探针分子。

优选地，该试剂盒还包括dna外切酶iii、脂质体2000、opti-mem培养基和pbs缓冲液。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于利用发黄色荧光的aie分子，用于标记dna探针分子，能够取得下列有益效果。

(1)tpe-py-ldna探针能够对活细胞内microrna进行荧光成像检测，组织、细胞等被紫外线照射后，会发出接近蓝光的荧光，而本申请中的探针中的染料分子激发后发出的荧光在黄光波段，从而可以很好地避免光吸收和背景荧光的干扰。

(2)探针在长时间激发后，荧光强度基本没有变化，因为探针中的荧光分子是聚集发光，形成的颗粒不容易被激发光穿透，光漂白现象不明显，从而可以长时间对活细胞内microrna进行荧光示踪分析。

(3)由于细胞内的环境很复杂，基质效应严重，需要很高的特异性，并且细胞内内容物质绝对量太低，靶标分子含量低，灵敏度要求很高，更重要的是探针能进入细胞内，并且探针的稳定性很高，不易被破坏，本发明实现了在细胞内microrna的原位荧光成像检测可以精确检测细胞内microrna的含量，可以进一步揭示癌症肿瘤的发生机制，对癌症早期诊断和治疗具有重要的意义。

附图说明

图1是按照本发明方法分别用tpe-py-ldna、fam-ldna探针和cy3-mbdna探针在活细胞内检测mir-21的原理图；

图2是(a)tpe-py-ldna转染mcf-7细胞后细胞荧光图；(b)对应的mcf-7细胞的三维立体图，激发波长是405nm，发射波长是560-620nm，比例尺为20μm；

图3是(a，d)在mcf-7细胞转染tpe-py-ldna后的细胞图像及荧光定量；(b，e)在hela细胞转染tpe-py-ldna后的细胞图像及荧光定量；(c，f)在hlf细胞转染tpe-py-ldna后的细胞图像及荧光定量；

图4是(a，d)在mcf-7细胞转染fam-ldna后的细胞图像及荧光定量；(b,e)在hela细胞转染fam-ldna后的细胞图像及荧光定量；(c，f)在hlf细胞转染fam-ldna后的细胞图像及荧光定量；

图5是(a，d)在mcf-7细胞转染cy3-mbdna后的细胞图像及荧光定量；(b,e)在hela细胞转染cy3-mbdna后的细胞图像及荧光定量；(c,f)在hlf细胞转染cy3-mbdna后的细胞图像及荧光定量；

图6是分别基于三种探针对mcf-7细胞内mir-21动态检测的细胞荧光图，(a,d)tpe-py-ldna探针的浓度是6.6μm；(b,e)fam-ldna探针的浓度是500nm；(c,f)cy3-mbdna探针的浓度是500nm。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

探针的合成：在5’端修饰炔基的一段dna序列(cagtctgataagcta-3’)，与式ⅰ分子反应，合成路线如下：

反应中，dna:式i化合物:溴化亚铜:抗坏酸钠＝1:10:11.5:23(摩尔比)；先利用循环水真空泵抽真空，然后将chognman氮气的气球套在反应器上，使整个环境充满氮气，反应温度为28℃～32℃，搅拌24小时左右，反应产物通过反向高效液相色谱纯化，最后通过质谱测试表征得到分子结构如式ⅱ所示的探针分子，用nanodrop^tmone定量后，冷冻干燥后，放在-20℃保存。

实施例2

步骤一：当mcf-7细胞(乳腺癌细胞)长到瓶底的80％时，将mcf-7细胞消化，接种4×10⁴个细胞于激光共聚焦培养皿中，加入培养基0.5ml，放入培养箱中培养24h。

步骤二：配制转染液，由a、b液组成，a中包括10μl脂质体2000和140μlopti-mem培养基；b中包括exoiii(1.33u/μl)、tpe-py-ldna探针(6.6μm)和opti-mem培养基，总体积是150μl。分别充分混匀，静置5min后，两个混合液充分混匀在一起，静置15min。

步骤三：将激光共聚焦培养皿中培养基去掉，加入1mlopti-mem培养基，培养2h，接着加入预先配制好的转染液，转染1h后，去掉转染液，用pbs缓冲液冲洗三次，放入适量的pbs，在60x物镜下对mcf-7细胞荧光成像和三维荧光图。从图2可以看出，tpe-py-ldna探针确实进入细胞内，而非粘附在细胞表面。

实施例3

步骤一和步骤二与实施例2中一样，第三步是利用tpe-py-ldna探针同时转染mcf-7细胞、hela细胞和hlf细胞，细胞转染后，在60x物镜下对所有细胞荧光成像。从图3得到的实验结果发现mcf-7细胞内中的荧光强度都要比hela细胞和hlf细胞内的强。

实施例4

步骤一和步骤二与实施例2中一样，第三步是利用fam-ldna探针同时转染mcf-7细胞、hela细胞和hlf细胞，细胞转染后，在60x物镜下对所有细胞荧光成像。从图4得到的实验结果发现mcf-7细胞内中的荧光强度都要比hela细胞和hlf细胞内的强。

实施例5

步骤一和步骤二与实施例2中一样，第三步是利用cy3-mbdna探针同时转染mcf-7细胞、hela细胞和hlf细胞，细胞转染后，在60x物镜下对所有细胞荧光成像。从图5得到的实验结果发现mcf-7细胞内中的荧光强度都要比hela细胞和hlf细胞内的强。

实施例6

在按照实施例2转染细胞后，第三步分别利用tpe-py-ldna探针、fam-ldna探针和cy3-mbdna探针转染mcf-7细胞，利用奥林巴斯fv2000激光共聚焦显微镜对细胞荧光成像，在第一张扫描图像结束后停止扫描，10min后，开始下一次原位扫描，扫描间隔是10min，总的扫描时间是60min。激发波长405nm，收集的荧光波长在515-615nm，从图6得到的实验结果发现tpe-py-ldna探针在细胞内长时间实验中效果最好。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。