本发明涉及用于从抗血清中纯化建兰花叶病毒高特异性抗体的一系列亲和填料及其制备方法，属于蛋白分离技术领域和免疫学检测技术领域。
背景技术：
建兰花叶病毒是主要危害兰花的一种病毒，能够导致兰花出现花叶、环斑、花朵畸形和植株早衰等症状，严重影响了兰花的观赏价值和经济价值，被许多国家和地区列为检疫对象。目前该病毒的检测主要采用间接elisa和双抗夹心elisa等血清学技术，这些技术的准确性主要依赖于检测抗体(igg)的特异性。
检测抗体主要来源是通过将病毒作为免疫原注射到兔、羊、鼠等哺乳动物，从而诱发动物产生特异结合病毒的抗体。进一步采集得到的动物血清就含有大量的病毒抗体，可用于一般的检测工作。不过，为进一步提高抗体特异性，就有必要通过抗体纯化步骤进一步提高抗体的浓度和降低非抗体蛋白的含量。
目前能够用于抗体纯化的技术包括：盐析法、辛酸沉淀法、离子交换法和亲和层析法等。其中最常用的是亲和层析法，该方法是利用受体与配体、抗体与抗原的特异性识别结合富集目标产物，其优点是可以通过简单的处理得到纯度较高的目标产物。抗体的亲和层析可以使用proteina、proteing、抗抗体、抗原等作为配基制备亲和填料，最常见的是采用蛋白a或蛋白g作为配基制备亲和填料。其中蛋白a是金黄色葡萄球细胞壁上的一种蛋白质，能够特异性地与哺乳动物抗体(主要是igg)的fc区结合，蛋白g是链球菌细胞壁蛋白，能够与抗体igg的恒定区、清蛋白、α2-巨球蛋白结合。因此，利用蛋白a、蛋白g的亲和填料纯化得到的抗体属于混合抗体，这种抗体的特异性较差。
采用蛋白a、蛋白g亲和层析纯化抗体的典型方法如下：(1)通过功能试剂修饰在填料表面形成nh2或cooh基团，通过戊二醛或双功能基团进一步修饰nh2或cooh得到活化填料；(2)将纯化的蛋白a或蛋白g加入活化填料中，通过共价键结合到填料，制备得到亲和填料；(3)使抗血清粗溶液经过固定蛋白a货蛋白g的填料，使igg吸附到填料上；(4)用中性的缓冲液冲洗填料，去除其他杂质；(4)使用酸性缓冲液(ph2.5～ph3.0)洗脱吸附在填料上的igg；(5)调整洗脱液ph值至中性，得到纯化的igg。
另外，还可以采用抗原作为配基制备亲和填料，应用于抗体纯化可以得到亲和力好、特异性强、纯度高的抗体。发明(2015103209206)将变性抗原蛋白(如原核表达的包涵体蛋白)直接偶联在固相载体以纯化抗体,简化了操作步骤,即制备可溶性抗原蛋白过程，所得抗体具有极高的纯度和特异性,适合于实验室制备和工业生产中应用。文献封琳等猪瘟病毒抗原与环氧氯丙烷活化的sepharose-4b偶联，制备成免疫亲和层析柱用于该病毒抗体的纯化，得到纯度高、活性强的病毒抗体。不过，由于采用的是全抗原，纯化得到的抗体识别也属于混合抗体，无法用于病原体株系、分离物的准确鉴定。
近年来，人们随着研究工作的深入，发现侵染兰花的建兰花叶病毒存在大量的株系、分离物的变异，这些变异导致不同株系的致病性存在较大差别，其中强致病株能够导致更严重的病症，而弱病毒影响兰花程度较低。再者，随着研究的进一步深入，人们还发现弱病株感染后的兰花能够减缓强病株的感染危害，存在一定程度的交叉保护作用；另一方面，人们还从兰花病株上发现许多未知的病毒种类，其中有部分和建兰花叶病毒非常相似，一直被当作该病毒进行防治，导致防治工作事倍功半。可见，准确鉴定病毒和病毒株系对于防治工作至关重要，现有抗体的纯化技术无法对抗体进行更细致的纯化，。
鉴于此本发明提供了一种能够用于从抗血清中纯化特异性抗体的一系列多肽配基亲和介质，满足抗体纯化的需要。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种建兰花叶病毒抗体亲和填料及其制备方法，其可以满足抗体纯化的需要。
本发明采用以下技术方案：
一种建兰花叶病毒抗体亲和填料的制备方法，采用氨基硅烷对填料表面进行修饰、原位合成连接臂后，进一步修饰的配基是建兰花叶病毒外壳蛋白不同区域的多肽片段，使填料能够吸附外壳蛋白不同区域的特异性抗体。
所述多肽片段为选择位于病毒特异保守区的片段，进一步分析这些片段氨基酸残基的亲水性、表面可及性和抗原性。
多肽片段为包括cp蛋白n端至c端，最短为6个氨基酸长度、最长为30个氨基酸长度的一系列多肽片段。
所述的多肽配基对应于建兰花叶病毒外壳蛋白不同区域的多肽片段，长度为6-30个氨基酸残基。
采用0.1％-20％氨基硅烷溶液，加到填料中于室温静置30min-12h进行填料的nh2修饰。
采用fmoc法或boc法在表面带有氨基修饰的填料或其它带有nh2基团填料上进行原位合成多肽，得到“g(n)s”多肽连接，其中n代表g的数量，分别为3-20，其末端带有nh2基团。
通过偶联法将多肽片段偶联到填料同样可以制备到相同的亲和填料。
偶联法为戊二醛法、活化酯法、碳二亚胺法、琥珀酸酐法和重氮化法中任意一种。
将抗血清用0.05m-0.2mpbs稀释后，加入亲和填料中静置1-3小时，然后用pbs溶液洗涤去除非特异抗体和其他杂质；再用ph3.0-4.0的甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或其它洗脱溶液进行抗体的洗脱，将洗脱下来的一系列抗体溶液用naoh、naco3等碱性溶液调整ph至中性，透析除盐后得到纯化的抗体。
填料为多孔玻璃、玻璃纤维、硅胶、树脂、琼脂糖凝胶、磁性微粒材料、纤维素中的任意一种。
一种建兰花叶病毒抗体亲和填料其通过上述制备方法制备得到。
本发明的优点是：本发明的建兰花叶病毒抗体亲和填料能够用于纯化针对外壳蛋白不同区域的检测抗体，可以用于病毒检测工作，可以用于病毒株系、分离物的区别鉴定工作。
具体实施方式
本发明的目的是利用建兰花叶病毒外壳蛋白氨基酸序列信息，合成一系列多肽片段作为配基偶联到填料制备一系列的亲和填料，所述的建兰花叶病毒抗体亲和填料可以从建兰花叶病毒抗血清中纯化得到针对不同片段的抗体。该方法能够纯化得到针对病毒特定氨基酸残基的检测抗体，其特异性远高于蛋白a、蛋白g亲和层析纯化的抗体，而且操作简便、对设备要求简单。
为了实现该目的，本发明的技术方案是：
根据建兰花叶病毒外壳蛋白氨基酸序列，优选具有一定亲水性、表面可及性或抗原性序列，设计长度为6-30个氨基酸残基的一系列多肽片段；采用氨基硅烷对包括多孔玻璃、玻璃纤维、硅胶、树脂、琼脂糖凝胶、磁性微粒材料、纤维素(如棉花、纤维层析纸)进行氨基化修饰得到氨基修饰填料；采用常规fmoc或boc法在上述氨基修饰填料进一步合成连接臂“gns”(其中n代表g的数量，分别为3-20)，其末端带有nh2基团；以上述的表面修饰填料或其它常见带有nh2基团的填料为基材，采用fmoc法或boc法进行多肽片段的原位合成得到多肽配基亲和填料；本发明也包括采用常规的化学合成得到多肽片段后，通过戊二醛法、活化酯法、碳二亚胺法、琥珀酸酐法和重氮化法或其它常见的偶联法将多肽片段偶联到填料制备得到亲和填料。根据多肽与抗体亲和力较低的特性，在抗体纯化过程中，优选ph3.5-4.5的洗脱缓冲液，从而减少对抗体活性的破坏。
本发明包括的实验步骤是：
1)多肽片段的设计
首先根据cymvcp氨基酸序列保守，选择位于病毒特异保守区的片段；进一步分析这些片段氨基酸残基的亲水性、表面可及性和抗原性；优选包括cp蛋白n端至c端，最短为6个氨基酸长度、最长为30个氨基酸长度的一系列多肽片段。
2)填料的氨基修饰
采用0.1％-20％氨基硅烷溶液，加到填料中于室温静置30min-12h进行填料的nh2修饰。采用常规fmoc或boc法在nh2修饰的填料上进一步合成连接臂“gns”。
3)多肽片段的原位合成
采用fmoc法或boc法在上述表面带有氨基修饰的填料或其它带有nh2基团填料上进行原位合成多肽，所述的多肽是上述优选的多肽。
4)多肽片段配基的固定
采用化学合成法进行上述优选的多肽片段的合成后，采用戊二醛法、活化酯法、碳二亚胺法、琥珀酸酐法和重氮化法或其它常见的偶联法将多肽片段偶联到填料同样可以制备到相同的亲和填料。
5)抗体的纯化
将抗血清用0.05m-0.2mpbs稀释后，加入到本发明制备的一系列亲和填料中静置1-3小时，然后用pbs溶液洗涤去除非特异抗体和其他杂质；再用ph3.0-4.0的甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或其它洗脱溶液进行抗体的洗脱。将洗脱下来的一系列抗体溶液用naoh、naco3等碱性溶液调整ph至中性，透析除盐后得到一系列纯化的抗体。
本发明的主要优点是通过纯化可以得到一系列针对病毒不同蛋白片段的抗体，而且可以采用较温和的洗脱条件从而保证了抗体的活性。
实施实例一
本实施实例为cymvcp“tdreraahs”多肽片段为例，描述针对该片段的抗体亲和填料的制备方法；并进一步比较了纯化抗体和蛋白a亲和纯化抗体的特异性实验，说明本发明亲和填料的优点。
下述实施实例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施实例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1材料
1.1主要实验设备与耗材
玻璃纤维为市场购买；采用3次肌肉注射和1次静脉注射免疫程序，以建兰花叶病毒为免疫原免疫家兔，测定效价达1:25000后采集兔抗血清。
2方法
2.1玻璃纤维的表面nh2修饰
取10g玻璃纤维，用浓硫酸和30％双氧水v/v3:1浸泡5min，用纯水清洗至中性，120℃热风干燥。待玻璃纤维冷却至室温后，加入5％氨基硅烷无水乙醇溶液浸泡4小时，滤干后，用10倍体积纯水冲洗，80℃热风干燥，得到氨基修饰的玻璃纤维填料。
2.2多肽片段的原位合成
采用fmoc法以填料表面的nh2基团为基础，首先合成1当量的丝氨酸，再进一步合成3个连续的甘氨酸形成“gggs”多肽连接臂，最后合成cymvcp171-179aa对应的多肽片段“tdreraahs”，形成“tdreraahsgggs-玻璃纤维”的亲和层析介质。本发明氨基和羧基缩合反应均使用mhbtu、diepc为缩合剂，采用常规固相合成方法进行。
2.3抗体纯化
将亲和填料加入50ml亲和柱中，用100ml0.1mpbs平衡后备用；使用20mlpbs稀释1ml抗血清后加入到亲和柱中，37℃孵育1小时吸附特异性抗体；使用100mlpbs洗脱去除非特异性抗体和杂质；再使用0.005m磷酸溶液洗脱后，用2倍体积0.005naoh中和至中性，采用peg8000脱水和半透膜透析最终得到纯化抗体1ml。
2.4亲和柱的再生
用10倍体积0.01m磷酸冲洗亲和填料、再用纯水冲洗至中性，用5倍体积含20％乙醇的pbs平衡亲和柱，保存于4℃。
2.5纯化抗体浓度测定
以bsa为标准，采用考马斯亮蓝g-250法绘制标准曲线，进行纯化抗体浓度测定。
2.6抗体效价测定
以1ng/ml的病毒粒体包被酶标板，并包被bsa为阴性对照，采用纯化前抗血清和纯化后抗体分别测定抗体效价。
2.7抗体特异性实验
采用纯化前抗血清和纯化后抗体分别检测感染cymv的蝴蝶兰叶片、健康蝴蝶兰叶片、马铃薯x病毒阳性对照和健康马铃薯叶片等样品，比较纯化实验对抗体特异性的影响。
3结果
3.1纯化抗体浓度
采用考马斯亮蓝g-250法测定表明纯化抗体的浓度为10ng/ml,约为抗血清浓度的1/1000，表明纯化实验去除了大量的非特异蛋白。
3.2抗体效价测定
通过间接elisa测定纯化前抗血清和纯化抗体的效价，结果表明纯化前抗血清效价为1:25000；纯化后的抗体效价1:5000。
3.3抗体特异性实验
纯化前抗血清与cymv阳性样品存在明显的亲和反应，显色反应明显(a405＝0.487±0.024)，不过用于检测马铃薯x病毒阳性样品时出现了一定的交叉反应(a405＝0.0.288±0.004)，而且检测健康样品显色显色本底较高(a405＝0.147±0.034)，影响了检测结果的评定；纯化后的抗体与cymv阳性样品发生明显亲和反应，虽然显色反应有所减低(a405＝0.325±0.002)，但是不与健康蝴蝶兰叶片发生交叉反应(a405＝0.024±0.010)、也不与马铃薯x病毒阳性对照发生交叉反应(a405＝0.031±0.017)。
实施实例二
本实施实例为cymvcp“186rqriqngnlitn200”多肽片段为例，描述针对该片段的抗体亲和填料的制备方法；并进一步比较了纯化抗体和蛋白a亲和纯化抗体的特异性实验，说明本发明亲和填料的优点。
下述实施实例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施实例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1材料
1.1主要实验设备与耗材
100目硅胶为市场购买；采用3次肌肉注射和1次静脉注射免疫程序，以建兰花叶病毒为免疫原免疫家兔，测定效价达1:25000后采集兔抗血清。
2方法
2.1玻璃纤维的表面nh2修饰
取10g100目硅胶，用浓硫酸和30％双氧水v/v3:1浸泡5min，用纯水清洗至中性，120℃热风干燥。待硅胶冷却至室温后，加入5％氨基硅烷无水乙醇溶液浸泡4小时，滤干后，用10倍体积纯水冲洗，80℃热风干燥，得到氨基修饰的硅胶填料。
2.2连接臂的原位合成
采用fmoc法以填料表面的nh2基团为基础，首先合成1当量的丝氨酸，再进一步合成3个连续的甘氨酸形成“gggs”多肽连接臂，其末端带有nh2基团。
2.3采用化学合成得到10mg的多肽片段“rqriqngnlitn”，通过戊二醛法偶联到填料连接臂nh2，得到“rqriqngnlitngggs-硅胶”的亲和层析介质。
2.4抗体纯化
将亲和填料加入50ml亲和柱中，用100ml0.1mpbs平衡后备用；使用20mlpbs稀释1ml抗血清后加入到亲和柱中，37℃孵育1小时吸附特异性抗体；使用100mlpbs洗脱去除非特异性抗体和杂质；再使用0.005m磷酸溶液洗脱后，用2倍体积0.005naoh中和至中性，采用peg8000脱水和半透膜透析最终得到纯化抗体1ml。
2.4亲和柱的再生
用10倍体积0.01m磷酸冲洗亲和填料、再用纯水冲洗至中性，用5倍体积含20％乙醇的pbs平衡亲和柱，保存于4℃。
2.5纯化抗体浓度测定
以bsa为标准，采用考马斯亮蓝g-250法绘制标准曲线，进行纯化抗体浓度测定。
2.6抗体效价测定
以1ng/ml的病毒粒体包被酶标板，并包被bsa为阴性对照，采用纯化前抗血清和纯化后抗体分别测定抗体效价。
2.7抗体特异性实验
采用蛋白a纯化抗体和本发明亲和填料纯化抗体分别检测感染cymv的蝴蝶兰叶片、健康蝴蝶兰叶片、马铃薯x病毒阳性对照和健康马铃薯叶片等样品，比较纯化实验对抗体特异性的影响。
3结果
3.1纯化抗体浓度
采用考马斯亮蓝g-250法测定表明纯化抗体的浓度为10ng/ml,约为抗血清浓度的1/1000，表明纯化实验去除了大量的非特异蛋白。
3.2抗体效价测定
通过间接elisa测定纯化前抗血清和纯化抗体的效价，结果表明纯化前抗血清效价为1:25000；纯化后的抗体效价1:4000。
3.3抗体特异性实验
蛋白a纯化抗体与cymv阳性样品存在明显的亲和反应，显色反应明显(a405＝0.544±0.015)，不过用于检测马铃薯x病毒阳性样品时出现了一定的交叉反应(a405＝0.287±0.047)，而且检测健康样品显色,显色本底较高(a405＝0.172±0.044)，影响了检测结果的评定；纯化后的抗体与cymv阳性样品发生明显亲和反应，虽然显色反应有所减低(a405＝0.417±0.011)，但是不与健康蝴蝶兰叶片发生交叉反应(a405＝0.031±0.005)、也不与马铃薯x病毒阳性对照发生交叉反应(a405＝0.011±0.001)。
实施实例三
本实施实例为cymvcp“180igkygalarqriqngnlitniaevtkghlg209”多肽片段为例，描述针对该片段的抗体亲和填料的制备方法；并进一步比较了纯化抗体和蛋白a亲和纯化抗体的特异性实验，说明本发明亲和填料的优点。
下述实施实例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施实例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1材料
1.1主要实验设备与耗材
cnbr活化琼脂糖凝胶；采用3次肌肉注射和1次静脉注射免疫程序，以建兰花叶病毒为免疫原免疫家兔，测定效价达1:25000后采集兔抗血清。
2方法
2.1多肽合成
通过fmoc法合成得到10mg多肽片段“igkygalarqriqngnlitniaevtkghlg”，溶解于10ml的ph9.00.25m碳酸钠缓冲液中。加入10ml填料，在摇床上振荡，25℃偶联6小时。然后加50mg甘氨酸，再反应6个小时封闭剩余的基团，得到亲和填料。
2.3抗体纯化
将亲和填料加入50ml亲和柱中，用100ml0.1mpbs平衡后备用；使用20mlpbs稀释1ml抗血清后加入到亲和柱中，37℃孵育1小时吸附特异性抗体；使用100mlpbs洗脱去除非特异性抗体和杂质；再使用0.005m磷酸溶液洗脱后，用2倍体积0.005naoh中和至中性，采用peg8000脱水和半透膜透析最终得到纯化抗体1ml。
2.4亲和柱的再生
用10倍体积0.01m磷酸冲洗亲和填料、再用纯水冲洗至中性，用5倍体积含20％乙醇的pbs平衡亲和柱，保存于4℃。
2.5纯化抗体浓度测定
以bsa为标准，采用考马斯亮蓝g-250法绘制标准曲线，进行纯化抗体浓度测定。
2.6抗体效价测定
以1ng/ml的病毒粒体包被酶标板，并包被bsa为阴性对照，采用纯化前抗血清和纯化后抗体分别测定抗体效价。
2.7抗体特异性实验
采用纯化前抗血清和纯化后抗体分别检测感染cymv的蝴蝶兰叶片、健康蝴蝶兰叶片、马铃薯x病毒阳性对照和健康马铃薯叶片等样品，比较纯化实验对抗体特异性的影响。
3结果
3.1纯化抗体浓度
采用考马斯亮蓝g-250法测定表明纯化抗体的浓度为10ng/ml,约为抗血清浓度的1/1000，表明纯化实验去除了大量的非特异蛋白。
3.2抗体效价测定
通过间接elisa测定纯化前抗血清和纯化抗体的效价，结果表明纯化前抗血清效价为1:25000；纯化后的抗体效价1:5000。
3.3抗体特异性实验
纯化前抗血清与cymv阳性样品存在明显的亲和反应，显色反应明显(a405＝0.456±0.004)，不过用于检测马铃薯x病毒阳性样品时出现了一定的交叉反应(a405＝0.245±0.045)，而且检测健康样品显色显色本底较高(a405＝0.178±0.054)，影响了检测结果的评定；纯化后的抗体与cymv阳性样品发生明显亲和反应，虽然显色反应有所减低(a405＝0.387±0.021)，但是不与健康蝴蝶兰叶片发生交叉反应(a405＝0.043±0.010)、也不与马铃薯x病毒阳性对照发生交叉反应(a405＝0.015±0.001)。
由此可见纯化得到的抗体虽然得率较低，导致效价下降，但是得到的抗体特异性得到明显的上升，更有利于提高检测的准确性。
传统的蛋白a、蛋白g亲和技术，使用蛋白a、蛋白g作为配基，偶联到填料制备建亲和填料，蛋白a、蛋白g能够特异吸附抗体(igg)，能够从抗病毒血清中纯化得到所有igg抗体，是一种混合抗体。纯化得到的igg是一种混合物，含有病毒特异性抗体和大量其他蛋白的抗体。这种抗体在应用过程中，会与杂蛋白、相似病毒发生非特异性反应，导致检测准确性差。
现有技术的“免疫亲和层析法快速纯化猪瘟病毒抗体”，使用病原体全蛋白作为配基，偶联到填料制备亲和填料，其利用抗原-抗体亲和反应，能够从抗病毒血清中纯化得到检测该病毒所有抗原表位的igg抗体，能够有效去除非特异性抗体。这种抗体不会与其他杂蛋白发生非特异性反应，纯化得到igg抗体能够与病毒所有抗原表位发生反应。因此，这种抗体在应用过程中，容易受其它相似或相近病毒种类的影响，从而导致假阳性出现。
本发明使用建兰花叶病毒(cymv)颗粒表面的抗原表位多肽作为配基，偶联到填料制备亲和填料，利用抗原表位多肽-抗体亲和反应，能够从抗病毒血清中纯化得到特定抗原表位的igg抗体，是一种单一抗体，纯化得到的抗体可以检测病毒的特定片段，这种抗体不与其它相似、相近病毒和其它杂蛋白发生反应，准确性较高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。