本发明涉及一种微生物限度检查方法，尤其是一种壮腰健肾丸微中生物限度的检查方法，属于化学检测技术领域。
背景技术：
壮腰健肾丸具有壮腰健肾、养血、祛风湿的作用，用于治疗肾亏腰痛、膝软无力、小便频数、风湿骨痛、神经衰弱。药品中的成分含有狗脊、黑老虎、千斤拔、桑寄生(蒸)、女贞子(蒸)、鸡血藤、金樱子、牛大力、菟丝子(盐水制)等。根据其用药途径和制法，应进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定，及控制菌——大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌、沙门氏菌的检查。
技术实现要素：
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种操作简单，检测结果准确可靠的壮腰健肾丸微中生物限度的检查方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样的：
一种壮腰健肾丸微中生物限度的检查方法，依次包括下述步骤：
1)菌液制备
2)供试液制备
3)方法建立及回收率试验
常规法：
试验组：吸取1:10供试液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液，摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；另从真菌试管中分别吸取1ml至平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；每株试验菌平行制备2个平皿；
菌液对照组：吸取胰酪大豆胨液体培养基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液，摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；另从真菌试管中分别吸取1ml至平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；每株试验菌平行制备2个平皿；
供试品组：吸取1:10供试液1ml至平皿，平行制备4个平皿，其中2个倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，另外2个倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；
稀释剂组：吸取胰酪大豆胨液体培养基1ml至平皿，平行制备4个平皿，其中2个倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，另外2个倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。
各平皿倾注规定的琼脂培养基，待凝固后，分别置规定温度培养3－5d，测定需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，计算其回收率。
4)控制菌检验方法的建立及验证
4.1)菌悬液制备
取含菌量为1000～10000cfu/ml的铜绿假单胞菌悬液，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释制成含菌数为10～100cfu/ml的菌悬液，备用。
取经33℃培养24h的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌胰酪大豆胨液体培养液，用0.9％无菌氯化钠溶液制成含菌数为10～100cfu/ml的菌悬液，备用；
4.2)供制备试液
4.3)试验方法：
取供试品组样品做大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌和沙门氏菌检查；
取供试品组样品，加入相应的阳性菌菌液1ml进行培养，作大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌和沙门氏菌检查；
取稀释液10ml做大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌和沙门氏菌检查，作为阴性对照。
优选的，上述的一种壮腰健肾丸微中生物限度的检查方法，所述的菌液制备的制备方法为：取经33℃培养24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌胰酪大豆胨液体培养液及25℃培养24h的白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养液，用0.9％无菌氯化钠溶液制成含菌数为1000～10000cfu/ml的菌悬液，备用；取经25℃培养7天的黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂斜面，加入5ml含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，用带有棉花的球形吸管吸出孢子悬液，用含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成含孢子数为1000～10000cfu/ml的孢子悬液，备用。
优选的，上述的一种壮腰健肾丸微中生物限度的检查方法，所述的供试液的制备方法为：取本品10g，加入预热至45℃的胰酪大豆胨液体培养基至100ml，45℃气浴振摇30min，混匀，作为1:10供试液。
优选的，上述的一种壮腰健肾丸微中生物限度的检查方法，所述的大肠埃希菌的制备方法为：取1：10供试液10ml接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养24h。取培养物1.0ml，接种至100ml麦康凯液体培养基中，44℃培养24h，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板，33℃培养24h，观察其菌落形态。
优选的，上述的一种壮腰健肾丸微中生物限度的检查方法，所述的耐胆盐革兰阴性菌的制备方法为：取10ml肠道菌增菌液体培养基管1支，加入1:10的供试液1ml，，33℃培养24h。取培养物划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板，33℃培养24h，观察其菌落形态。
优选的，上述的一种壮腰健肾丸微中生物限度的检查方法，所述的沙门氏菌的检查方法为：取本品10g，加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养24h。取培养物0.1ml，接种至10mlrv沙门菌增菌液体培养基中，33℃培养24h，取rv沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板，33℃培养24h，观察其菌落形态。
本发明与现有技术相比，具有以下优势：
本发明提供的方法，微生物计数法、1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、1107非无菌药品微生物限度标准有关规定，进行微生物限度检查方法适用性试验，以确保检查方法的准确、可靠。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的权利要求书做进一步说明，但不构成对本发明的任何限制，任何对本发明做有限次修改可得的技术方案仍然属于本发明所要保护的范围。
实施例1
1、实验用品
1.l仪器设备
生物安全柜、生化培养箱、全自动压力灭菌器、电热恒温干燥箱、电冰箱、微波炉、恒温水浴箱、电子天平(感量0.1g)、thermoscientificmaximixii涡旋振荡器、气浴恒温振荡器、匀浆仪。
1.2玻璃器皿
锥形瓶、平皿、烧杯、分度吸管、试管及硅胶塞，均于180℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌15min。
1.3用具
无菌衣、帽、口罩、手套、皮乳头、接种环、酒精灯、酒精棉球及碘伏棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、灭菌过滤筒、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、实验记录纸等。
1.4试液及培养基
l.4.1消毒液
0.1％苯扎溴铵溶液(供洗手、擦拭操作台面用)，5％苯酚溶液(配好后装入玻璃消毒缸内供消毒带菌吸管用)、75％乙醇溶液、碘伏溶液。
1.4.2稀释剂
0.9％无菌氯化钠溶液(稀释菌液用)、含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液、胰酪大豆胨液体培养基(稀释供试品用)。
1.4.3培养基
胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、肠道菌增菌液体培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、rv沙门菌增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基。
1.5样品
壮腰健肾丸，批号：1816006、1816005、1816004，生产厂家：广西灵峰药业有限公司
2、需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验的建立及验证
2.1菌种
铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)[cmcc(b)10104]
金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)[cmcc(b)26003]
枯草芽孢杆菌(.bacillussulticis)[cmcc(b)63501]
白色念珠菌(candidaalbicans)[cmcc(f)98001]
黑曲霉(aspeigillusniger)[cmcc(f)98003]
中国食品药品检定研究院提供
2.2菌液制备
取经33℃培养24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌胰酪大豆胨液体培养液及25℃培养24h的白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养液，用0.9％无菌氯化钠溶液制成含菌数为1000～10000cfu/ml的菌悬液，备用；取经25℃培养7天的黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂斜面，加入5ml含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，用带有棉花的球形吸管吸出孢子悬液，用含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成含孢子数为1000～10000cfu/ml的孢子悬液，备用。
2.3供试液制备
取本品10g，加入预热至45℃的胰酪大豆胨液体培养基至100ml，45℃气浴振摇30min，混匀，作为1:10供试液。
2.4方法建立及回收率试验
2.4.1常规法：
试验组：吸取1:10供试液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液，摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；另从真菌试管中分别吸取1ml至平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；每株试验菌平行制备2个平皿；
菌液对照组：吸取胰酪大豆胨液体培养基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液，摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；另从真菌试管中分别吸取1ml至平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；每株试验菌平行制备2个平皿；
供试品组：吸取1:10供试液1ml至平皿，平行制备4个平皿，其中2个倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，另外2个倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；
稀释剂组：吸取胰酪大豆胨液体培养基1ml至平皿，平行制备4个平皿，其中2个倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，另外2个倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。
各平皿倾注规定的琼脂培养基，待凝固后，分别置规定温度培养3－5d，测定需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，计算其回收率，见表1。
表1回收率试验结果：常规法
结果显示，需氧菌总数的各株试验菌回收率均在50％－200％，表明壮腰健肾丸对细菌有无抑制作用，采用常规法进行需氧菌总数测定可行。
霉菌和酵母菌总数的各株试验菌回收率均在50％－200％，表明壮腰健肾丸对真菌无抑制作用，采用常规法进行霉菌和酵母菌总数测定可行。
2.5方法验证
取1批供试品，批号为：1816006，按常规法进行需氧菌总数、常规法进行霉菌和酵母菌总数的计数方法验证，结果见2至表5：
表2第一次试验结果
表3第二次试验结果
表4第三次试验结果
3次验证试验总结：
表4壮腰健肾丸----需氧菌总数计数方法适用性试验回收率
表5壮腰健肾丸----霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验回收率
3次验证试验结果表明，以常规法进行壮腰健肾丸需氧菌总数、以常规法进行霉菌和酵母菌总数测定，五株试验菌的回收率均在50％－200％，符合《中国药典》2015年版四部1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的规定，方法可行。
确定采用常规法进行壮腰健肾丸的非无菌产品微生物限度检查中需氧菌总数检查，采用常规法进行壮腰健肾丸的非无菌产品微生物限度检查中霉菌和酵母菌总数检查。
3、控制菌检验方法的建立及验证
3.1菌种
大肠埃希菌(escherichiacoli)[cmcc(b)44102]
铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)[cmcc(b)10104]
乙型副伤寒沙门氏菌(salmonellaparatyphi)[cmcc(b)50094]
中国食品药品检定研究院提供
3.1.1菌悬液制备同2.2
取2.2下含菌量为1000～10000cfu/ml的铜绿假单胞菌悬液，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释制成含菌数为10～100cfu/ml的菌悬液，备用。
取经33℃培养24h的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌胰酪大豆胨液体培养液，用0.9％无菌氯化钠溶液制成含菌数为10～100cfu/ml的菌悬液，备用；
3.2供试液的制备同2.3
3.3试验方法：
供试品组取规定量的样品照“3.3.1”、“3.3.2”、“3.3.3”操作做控制菌检查法检查。
阳性对照试验取规定量的样品照“3.3.1”、“3.3.2”、“3.3.3”操作，并加入相应的阳性菌菌液1ml进行培养，作相应控制菌检查法检查。
阴性对照试验取稀释液10ml代替供试液照“3.3.1”、“3.3.2”、“3.3.3”做控制菌检查法检查，作为阴性对照。
3.3.1大肠埃希菌：
取1：10供试液10ml接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养24h。取培养物1.0ml，接种至100ml麦康凯液体培养基中，44℃培养24h，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板，33℃培养24h，观察其菌落形态。
3.3.2耐胆盐革兰阴性菌：
取10ml肠道菌增菌液体培养基管1支，加入1:10的供试液1ml，，33℃培养24h。取培养物划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板，33℃培养24h，观察其菌落形态。
3.3.3沙门氏菌：
取本品10g，加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养24h。取培养物0.1ml，接种至10mlrv沙门菌增菌液体培养基中，33℃培养24h，取rv沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板，33℃培养24h，观察其菌落形态。
3.4试验结果
3.3.1大肠埃希菌：
供试品组：在麦康凯琼脂平板中无菌落生长；
阳性对照组：在麦康凯琼脂平板中有典型大肠埃希菌菌落生长；革兰氏染色镜检为g-杆菌，生化鉴定结果为典型大肠埃希氏菌生化反应，结果见表6。
表6大肠埃希菌实验结果
阴性对照组：在麦康凯琼脂平板中无菌落生长；
表明壮腰健肾丸可采用常规法进行大肠埃希菌检验，方法可行。
3.3.2耐胆盐革兰阴性菌：
供试品组：在紫红胆盐葡萄糖琼脂平板中无菌落生长；
阳性对照组：
大肠埃希菌阳性对照组：在紫红胆盐葡萄糖琼脂平板中有菌落生长；
铜绿假单胞菌阳性对照组：在紫红胆盐葡萄糖琼脂平板中有菌落生长；
阴性对照组：在紫红胆盐葡萄糖琼脂平板中无菌落生长；
表明壮腰健肾丸可采用常规法进行耐胆盐革兰阴性菌检验，方法可行。
3.3.3耐胆盐革兰阴性菌：
供试品组：在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板中无菌落生长；
阳性对照组：在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板中有典型沙门氏菌菌落生长；革兰氏染色镜检为g-杆菌，初步生化鉴定结果为典型沙门氏菌属生化反应。
表7耐胆盐革兰阴性菌实验结果
阴性对照组：在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板中无菌落生长；
表明壮腰健肾丸可采用常规法进行沙门氏菌检验，方法可行。
3.5确定壮腰健肾丸的非无菌产品微生物限度检查中控制菌检查方法为常规法。
4结论
经过验证：确定采用常规法进行壮腰健肾丸的非无菌产品微生物限度检查中需氧菌总数检查，采用常规法进行壮腰健肾丸的非无菌产品微生物限度检查中霉菌和酵母菌总数检查。
采用常规法进行壮腰健肾丸的非无菌产品微生物限度检查中大肠埃希菌检查、耐胆盐革兰阴性菌、沙门氏菌。
5三批壮腰健肾丸的微生物限度检查
按所建立的壮腰健肾丸非无菌产品微生物限度检查法，对三批样品进行检验，结果见表8。
表8三批壮腰健肾丸的微生物限度检查
需要说明的是，本发明未详细涉及的技术参数，均按照本领域常规技术手段或者中国药典规定的参数进行。