一种用于糖尿病肾病早期诊断的试剂盒的制作方法

本发明涉及检测试剂盒领域，具体地说涉及一种用于糖尿病肾病早期诊断的试剂盒。

背景技术：

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。糖尿病肾病是糖尿病最主要且危害最大的并发症之一，是引起欧美等发达国家终末期肾病的首要原因(约44％)，也是导致我国终末期肾病的第二位原因，其起病隐匿，早期经治疗后多可逆转，晚期则发展成终末期肾病，如今糖尿病、肾病的发病率还在不断地上升。

目前传统的糖尿病肾病早期诊断方法均存在不足，国内外用于预测糖尿病、肾病及其发展趋势的传统检测方法为血肌酐检查、尿微量白蛋白检查或尿微量白蛋白与肌酐比(acr)检查，这种传统的血肌酐判断肾脏疾病的方法漏诊率较高；而对于尿微量白蛋白的诊断方法，事实上几乎所有1型及大部分2型糖尿病患者出现微量白蛋白尿时已有不同程度的肾脏损害，且很多患者有进行性肾脏损害，而尿白蛋白却没有增加，因此该方法特异度和敏感度均不够。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够提高早期糖尿病肾病检出率的用于糖尿病肾病早期诊断的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种用于糖尿病肾病早期诊断的试剂盒，包括尿微量白蛋白测试条、结合珠蛋白测试条以及肌酐测试条。

进一步地，所述尿微量白蛋白测试条包括第一底板以及从一端到另一端依次设置在所述第一底板上的第一玻璃纤维膜、第一硝酸纤维素膜和第一吸水纸，且所述第一玻璃纤维膜的另一端搭在所述第一硝酸纤维素膜的一端，所述第一吸水纸的一端搭在所述第一硝酸纤维素膜的另一端，所述第一玻璃纤维膜上喷涂有胶体金-鼠抗人白蛋白单克隆抗体，所述第一硝酸纤维素膜上包被有羊抗鼠igg抗体和重组人白蛋白。

进一步地，所述结合珠蛋白测试条包括第二底板以及从一端到另一端依次设置在所述第二底板上的第二玻璃纤维膜、第二硝酸纤维素膜和第二吸水纸，且所述第二玻璃纤维膜的另一端搭在所述第二硝酸纤维素膜的一端，所述第二吸水纸的一端搭在所述第二硝酸纤维素膜的另一端，所述第二玻璃纤维膜上喷涂有胶体金-鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体b，所述第二硝酸纤维素膜上包被有羊抗鼠igg抗体和鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体a。

进一步地，所述肌酐测试条包括第三底板以及设置在所述第三底板上的试剂层垫，所述试剂层垫中含有肌酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、4-氨基安替比林、过氧化物酶和toos。

进一步地，所述第一玻璃纤维膜上鼠抗人白蛋白单克隆抗体的含量为0.36μg，所述第一硝酸纤维素膜分为c区域和t区域，所述第一硝酸纤维素膜的c区域包被的羊抗鼠igg抗体的浓度为0.5mg/ml，t区域包被的重组人白蛋白的浓度为0.5mg/ml，包被量均为1μl/cm。

进一步地，所述第二玻璃纤维膜上鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体b的含量为0.5μg，所述第二硝酸纤维素膜分为c区域和t区域，所述第二硝酸纤维素膜的c区域包被的羊抗鼠igg抗体的浓度为0.5mg/ml，t区域包被的鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体a的浓度为1.5mg/ml，包被量均为1μl/cm。

进一步地，所述试剂层垫中含有1.5u肌酐酶、0.8u肌酸酶、0.65u肌氨酸氧化酶、2.5u过氧化物酶、10μg4-氨基安替比林和12.5μgtoos。

本发明的有益效果体现在：

本发明能够实现一份样本同时检测尿微量白蛋白、结合珠蛋白与肌酐三项指标，可将早期糖尿病肾病检出率提高至95％以上。

本发明检测的三项指标全部采用干式快速检测方案，便于操作，迅速出结果。

附图说明

图1是本发明一实施例中尿微量白蛋白测试条的结构示意图。

图2是本发明一实施例中肌酐测试条的结构示意图。

图3是本发明一实施例的结构示意图。

附图中各部件的标记为：1第一底板、2第一玻璃纤维膜、3第一硝酸纤维素膜、4第一吸水纸、01尿微量白蛋白加样孔、02结合珠蛋白加样孔、03肌酐加样孔、5第三底板、6试剂层垫。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本发明一实施例的用于糖尿病肾病早期诊断的试剂盒，包括尿微量白蛋白测试条、结合珠蛋白测试条以及肌酐测试条。

发明人研究发现结合珠蛋白与糖尿病早期肾功能下降及其进行性恶化密切相关，可作为另一种指标来监测糖尿病患者肾功能的改变。本发明通过同时检测尿微量白蛋白与肌酐比和结合珠蛋白，可将早期糖尿病肾病检出率提高至95％以上，意义重大。

在一实施例中，尿微量白蛋白测试条采用胶体金竞争法原理，参见图1，所述尿微量白蛋白测试条包括第一底板1以及从一端到另一端依次设置在所述第一底板1上的第一玻璃纤维膜2、第一硝酸纤维素膜3和第一吸水纸4，且所述第一玻璃纤维膜2的另一端搭在所述第一硝酸纤维素膜3的一端，所述第一吸水纸4的一端搭在所述第一硝酸纤维素膜3的另一端，所述第一玻璃纤维膜2上喷涂有胶体金-鼠抗人白蛋白单克隆抗体，所述第一硝酸纤维素膜3上包被有羊抗鼠igg抗体和重组人白蛋白。

优选的，所述第一玻璃纤维膜上鼠抗人白蛋白单克隆抗体的含量为0.36μg，所述第一硝酸纤维素膜分为c区域和t区域，所述第一硝酸纤维素膜的c区域包被的羊抗鼠igg抗体的浓度为0.5mg/ml，t区域包被的重组人白蛋白的浓度为0.5mg/ml，包被量均为1μl/cm。在实施本发明的过程中，发明人发现，此条件下，尿微量白蛋白测试条能够达到灵敏度0.5μg/ml，相对偏差b＜15％，变异系数cv＜10％。

与尿微量白蛋白测试条的结构类似，在一实施例中，所述结合珠蛋白测试条采用胶体金双抗体夹心法原理，所述结合珠蛋白测试条包括第二底板以及从一端到另一端依次设置在所述第二底板上的第二玻璃纤维膜、第二硝酸纤维素膜和第二吸水纸，且所述第二玻璃纤维膜的另一端搭在所述第二硝酸纤维素膜的一端，所述第二吸水纸的一端搭在所述第二硝酸纤维素膜的另一端，为简洁描述起见，不再附图示意，所述第二玻璃纤维膜上喷涂有胶体金-鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体b，所述第二硝酸纤维素膜上包被有羊抗鼠igg抗体和鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体a。

优选的，所述第二玻璃纤维膜上鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体b的含量为0.5μg，所述第二硝酸纤维素膜分为c区域和t区域，所述第二硝酸纤维素膜的c区域包被的羊抗鼠igg抗体的浓度为0.5mg/ml，t区域包被的鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体a的浓度为1.5mg/ml，包被量均为1μl/cm。在实施本发明的过程中，发明人发现，此条件下，结合珠蛋白测试条能够达到灵敏度5ng/ml，相对偏差b＜15％，变异系数cv＜10％。

具体实施中，所述第一玻璃纤维膜和第二玻璃纤维膜均为两段式结构，其中前一段的另一端搭在后一段的一端。靠近硝酸纤维素膜的一段被称为金标垫，其主要作用是承载胶体金-抗体复合物，而远离硝酸纤维素膜的一段被称为样品垫，这一段预先经过缓冲液处理，其主要作用是在吸收样本进行层析时缓冲尿样间的基质差异。

在一实施例中，所述肌酐测试条采用肌氨酸氧化酶法，参见图2，所述肌酐测试条包括第三底板5以及设置在所述第三底板5上的试剂层垫6，所述试剂层垫中含有肌酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、4-氨基安替比林、过氧化物酶和toos。

具体实施中，各底板均采用pvc板制成。

优选的，所述试剂层垫中含有1.5u肌酐酶、0.8u肌酸酶、0.65u肌氨酸氧化酶、2.5u过氧化物酶、10μg4-氨基安替比林和12.5μgtoos。在实施本发明的过程中，发明人发现，此条件下，肌酐测试条能够达到灵敏度0.05mg/ml，相对偏差b＜15％，变异系数cv＜10％。

参见图3，试剂盒上对应于所述尿微量白蛋白测试条的位置处具有尿微量白蛋白加样孔01，对应于所述结合珠蛋白测试条的位置处具有结合珠蛋白加样孔02，对应于所述肌酐测试条的位置处具有肌酐加样孔03，当在尿微量白蛋白加样孔中加入尿样时，样本沿着试纸层析流动，样本中含有的尿微量白蛋白与喷涂在第一玻璃纤维膜上的胶体金-鼠抗人白蛋白单克隆抗体结合，形成的复合物继续沿着试纸层析，剩余未结合尿微量白蛋白的胶体金-鼠抗人白蛋白单克隆抗体与包被在第一硝酸纤维素膜的t区域的重组人白蛋白结合，形成一条红色线条，样本中尿微量白蛋白含量越高，红色线条越淡。而无论样本中尿微量白蛋白含量为多少，包被于第一硝酸纤维素膜的c区域的羊抗鼠igg抗体都会与胶体金-鼠抗人白蛋白单克隆抗体结合，形成一条红色条带。由于样本中尿微量白蛋白的含量不同，t区域的红色线条深浅也不同，二者存在一定的曲线关系，因此依据仪器分析可对尿微量白蛋白进行定量测试。

当在结合珠蛋白加样孔中加入尿样时，样本沿着试纸层析流动，样本中含有的结合珠蛋白与喷涂在第二玻璃纤维膜上的胶体金-鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体b结合，形成的复合物继续沿着试纸层析，又与包被在第二硝酸纤维素膜的t区域的鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体a结合，形成一条红色线条，而无论样本中结合珠蛋白含量为多少，包被于第二硝酸纤维素膜的c区域的羊抗鼠igg抗体都会与胶体金-鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体b结合，形成一条红色条带。依据结合珠蛋白的含量不同，t区域的红色线条深浅也不同，二者存在一定的曲线关系，因此依据仪器分析可对结合珠蛋白进行定量测试。

当在肌酐加样孔中加入尿样时，样本中的肌酐被溶解出的肌酐酶转化成肌酸，肌酸在肌酸酶的作用下被转化成肌氨酸，肌氨酸在肌氨酸氧化酶的作用下与氧气反应生成甘氨酸与过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下与4-氨基安替比林和toos反应生成紫色络合物。尿样中肌酐含量越高，生成的紫色越深，二者在一定范围内存在线性关系，因此根据仪器分析可进行定量测试。

本发明测试条的检测方式可采用苦味酸速率法代替，肌酐试纸的试剂层垫上主要成分为碱性苦味酸试剂。肌酐与碱性苦味酸反应生成黄红色复合物，根据肌酐和碱性苦味酸形成复合物的速度与非肌酐干扰物的不同，且肌酐的反应速度与浓度成正比的关系，利用仪器测试不同时间试剂垫颜色深浅的信号值，用速率法得出定量结果。

发明人对尿微量白蛋白、尿微量白蛋白/肌酐、结合珠蛋白和尿微量白蛋白/肌酐+结合珠蛋白四项测试进行了综合对比，具体结果见下表1。

表1

结果表明，尿微量白蛋白对早期糖尿病肾病的检出率最低，尤其是2型糖尿病肾病；尿微量白蛋白/肌酐的检出率比尿微量白蛋白略高，但对2型糖尿病肾病检出率基本没有提升，因此整体检出率依然偏低；结合珠蛋白作为近年来新发现的糖尿病肾病检测指标，对于1型和2型糖尿病肾病均有着较高的检出率；而本发明采用的尿微量白蛋白/肌酐和结合珠蛋白的综合检测形成互补，将早期糖尿病肾病的整体检出率提升至95％以上。

应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。