一种凝胶或电泳迁移率实验的结合反应体系的工作流程的制作方法

本发明涉及dna结合蛋白领域，具体是一种凝胶或电泳迁移率实验的结合反应体系的工作流程。

背景技术：

dna结合蛋白又称螺旋失稳蛋白、dna解链蛋白或单链dna结合蛋白，是解链酶类中的一种类型，发现于原核生物的大肠杆菌细胞内，由相同亚基组成的四聚体，分子量8×104，与单键dna亲和力极大，与双链dna结合力较差。因此，当dna发生暂时性熔化时，它与dna单链区结合而促使反应偏向单链的形成，使dna在大大低于tm(解链温度)的温度下发生双链的分离，双螺旋则在复制叉的前方分开，并在复制叉处稳定单链结构，阻止再形成双螺旋。凝胶迁移或电泳迁移率实验(emsa)是一种研究dna结合蛋白和其相关的dna结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究dna结合蛋白，目前已用于研究rna结合蛋白和特定的rna序列的相互作用，但是现有的结合反应体系都只有一种，适用范围单一，对实验的可靠性有影响。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种凝胶或电泳迁移率实验的结合反应体系的工作流程，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种凝胶或电泳迁移率实验的结合反应体系的工作流程，具体步骤如下：

步骤一，处理探针：将新合成的探针瞬时离心并且沉落管底，再向管中加入双蒸水使得探针的浓度为100umol/l，将其震荡并且混合均匀，取部分探针溶液并且稀释至20umol/l，将稀释溶液与互补探针等体积混合，得到混合探针溶液，剩余的探针溶液在零下20摄氏度储存，将混合探针溶液在95摄氏度变性5分钟，然后在70摄氏度保持20分钟后，立刻放在室温环境使其缓慢冷却至室温，互补单链退火成双链探针；

步骤二，配胶：将0.5ml的10×tbe、2.17ml的丙烯酰胺、0.5ml的甘油、7.4ml的双蒸水、10ul的四甲基乙二胺和50ul的过硫酸铵脱气十分钟，即可得到聚丙烯胺溶液：

步骤三，预电泳：将0.5×tbe预冷，然后在100v下恒压30-60分钟；

步骤四，配制结合反应体系：采用2ul的结合缓冲液、1ul的聚乙烯、5ug的核蛋白、200ng的探针并且加双蒸水至20ul，得到第一结合反应体系；采用2ul的结合缓冲液、1ul的聚乙烯、1ul的氯化镁、5ug的核蛋白、200ng的探针并且加双蒸水至20ul，得到第二结合反应体系；采用2ul的结合缓冲液、1ul的聚乙烯、1ul的氯化镁、1ul的体积分数为1％的np40裂解液、5ug的核蛋白、200ng的探针并且加双蒸水至20ul，得到第一结合反应体系；采用2ul的结合缓冲液、1ul的聚乙烯、1ul的甘油、1ul的氯化镁、1ul的体积分数为1％的np40裂解液、5ug的核蛋白、200ng的探针并且加双蒸水至20ul，得到第四结合反应体系，将第一结合反应体系、第二结合反应体系、第三结合反应体系和第四结合反应体系置于4摄氏度的冰箱中孵育30分钟；

步骤五，电泳：将四种结合反应体系中加入5ul的加样缓冲液，用钱轻轻吹打并且混合均匀，冲洗加样孔3-5次，然后上样，电泳缓冲液采用步骤三中的缓冲液在100v恒压的低温环境下电泳1-2小时；

步骤六，转膜：配置1200ml的0.5×tbe电转移缓冲液，将尼龙膜、同凝胶大小的厚滤纸和电转移泡沫垫在电转移缓冲液中浸泡10分钟，标记结合膜的方向，电泳后，慢慢从电泳装置的凝胶上移走一片玻璃片，将凝胶与另一片玻璃一起移入装有0.5×tbe的盒中，在0.5×tbe中让凝胶板与玻璃板分离，使凝胶板漂浮在0.5×tbe中，取一片预浸湿的滤纸在0.5×tbe中移动到凝胶板下面，小心将滤纸与其上的凝胶板一起从0.5×tbe中移出，置于电转移泡沫垫上，装配电转移夹，将装配好的电转移夹放入电转移槽中，在0.5×tbe和100v恒压环境下转45分钟；

步骤七，交联固定dna：将转膜正面朝上放置在紫外线灯下10cm处，交联20分钟，交联前保持转膜湿润；

步骤八，结合膜预处理：将4摄氏度的封闭液和4摄氏度的4×洗涤液在37-50摄氏度的水浴中预热，使得白色沉淀溶解，将结合膜浸入20ml的封闭液中，室温下轻摇并且孵育15分钟，将20ml的封闭液与66.7ul的过氧化物酶-链亲和素复合物混合，得到过氧化物酶-链亲和素复合物反应液，将结合膜从封闭液中取出并且放入过氧化物酶-链亲和素复合物反应液中，将结合膜在1×washbuffer洗涤液中洗涤4次，每次在15ml的1×washbuffer洗涤液中洗涤5分钟，洗涤完毕的结合膜与30ml的平衡液在室温平衡5分钟；

步骤九，化学发光反应：将lightenhrp-b底物液a和lightenhrp-b底物液b按照体积比1∶1混合，在暗室将结合膜从平衡液中取出，放在不吸水的平面，再将发光液均匀覆盖在结合膜表面，将底物液覆盖于结合膜的表面并且反应1-4分钟，然后吸掉底物液并用纸巾从结合膜表面吸走多余的底物液，然后用一张透明纸盖在结合膜表面，其上再盖感光胶片。

作为本发明进一步的方案：丙烯酰胺的质量分数为30％，甘油的体积分数为50％，过硫酸铵的质量分数为10％。

作为本发明进一步的方案：预电泳前采用加样枪反复冲洗上样孔3-5次。

作为本发明进一步的方案：步骤四中结合缓冲液的ph值为7.5，结合缓冲液包括100mm的三羟甲基氨基甲烷、500mm的氯化钾和10mm的二硫苏糖醇。

作为本发明进一步的方案：步骤六中装配电转移夹的顺序为泡沫垫、厚滤纸、结合膜、凝胶板、厚滤纸和泡沫垫从正极向负极方向排列。

作为本发明进一步的方案：步骤八中1×washbuffer洗涤液采用15ml的4×washbuffer洗涤液与45ml的双蒸水混合得到。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明涉及emsa结合反应条件，该四种结合反应条件适用于不同的dna结合蛋白与dna的结合反应；通过筛选这四种结合反应条件，能够找到一种最适合的反应体系，提高实验的可靠性，适用范围广。

附图说明

图1是本发明实施例nfd与dna结合条件，结合反应1是最合适的反应体系。

图2是本发明实施例ets与dna结合条件，结合反应2是最合适的反应体系。

图3是本发明实施例mdl-1与dna结合条件，结合反应3是最合适的反应体系。

图4是本发明实施例myod与dna结合条件，结合反应4是最合适的反应体系。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

请参阅图1-4，一种凝胶或电泳迁移率实验的结合反应体系的工作流程，具体步骤如下：

步骤一，处理探针：将新合成的探针瞬时离心并且沉落管底，再向管中加入双蒸水使得探针的浓度为100umol/l，将其震荡并且混合均匀，取部分探针溶液并且稀释至20umol/l，将稀释溶液与互补探针等体积混合，得到混合探针溶液，剩余的探针溶液在零下20摄氏度储存，将混合探针溶液在95摄氏度变性5分钟，然后在70摄氏度保持20分钟后，立刻放在室温环境使其缓慢冷却至室温，互补单链退火成双链探针；

步骤二，配胶：将0.5ml的10×tbe、2.17ml的丙烯酰胺、0.5ml的甘油、7.4ml的双蒸水、10ul的四甲基乙二胺和50ul的过硫酸铵脱气十分钟，即可得到聚丙烯胺溶液；

步骤三，预电泳：采用加样枪反复冲洗上样孔3-5次，将0.5×tbe预冷，然后在100v下恒压30-60分钟；

步骤四，配制结合反应体系：采用2ul的结合缓冲液、1ul的聚乙烯、5ug的核蛋白、200ng的探针并且加双蒸水至20ul，得到第一结合反应体系；采用2ul的结合缓冲液、1ul的聚乙烯、1ul的氯化镁、5ug的核蛋白、200ng的探针并且加双蒸水至20ul，得到第二结合反应体系；采用2ul的结合缓冲液、1ul的聚乙烯、1ul的氯化镁、1ul的体积分数为1％的np40裂解液、5ug的核蛋白、200ng的探针并且加双蒸水至20ul，得到第一结合反应体系；采用2ul的结合缓冲液、1ul的聚乙烯、1ul的甘油、1ul的氯化镁、1ul的体积分数为1％的np40裂解液、5ug的核蛋白、200ng的探针并且加双蒸水至20ul，得到第四结合反应体系，结合缓冲液的ph值为7.5，结合缓冲液包括100mm的三羟甲基氨基甲烷、500mm的氯化钾和10mm的二硫苏糖醇，将第一结合反应体系、第二结合反应体系、第三结合反应体系和第四结合反应体系置于4摄氏度的冰箱中孵育30分钟；

步骤五，电泳：将四种结合反应体系中加入5ul的加样缓冲液，用钱轻轻吹打并且混合均匀，冲洗加样孔3-5次，然后上样，电泳缓冲液采用步骤三中的缓冲液在100v恒压的低温环境下电泳1-2小时；

步骤六，转膜：配置1200ml的0.5×tbe电转移缓冲液，将尼龙膜、同凝胶大小的厚滤纸和电转移泡沫垫在电转移缓冲液中浸泡10分钟，标记结合膜的方向，电泳后，慢慢从电泳装置的凝胶上移走一片玻璃片，将凝胶与另一片玻璃一起移入装有0.5×tbe的盒中，在0.5×tbe中让凝胶板与玻璃板分离，使凝胶板漂浮在0.5×tbe中，取一片预浸湿的滤纸在0.5×tbe中移动到凝胶板下面，小心将滤纸与其上的凝胶板一起从0.5×tbe中移出，置于电转移泡沫垫上，按照泡沫垫、厚滤纸、结合膜、凝胶板、厚滤纸和泡沫垫从正极向负极方向排列装配电转移夹，将装配好的电转移夹放入电转移槽中，在0.5×tbe和100v恒压环境下转45分钟；

步骤七，交联固定dna：将转膜正面朝上放置在紫外线灯下10cm处，交联20分钟，交联前保持转膜湿润；

步骤八，结合膜预处理：将4摄氏度的封闭液和4摄氏度的4×洗涤液在37-50摄氏度的水浴中预热，使得白色沉淀溶解，将结合膜浸入20ml的封闭液中，室温下轻摇并且孵育15分钟，将20ml的封闭液与66.7ul的过氧化物酶-链亲和素复合物混合，得到过氧化物酶-链亲和素复合物反应液，将结合膜从封闭液中取出并且放入过氧化物酶-链亲和素复合物反应液中，将结合膜在1×washbuffer洗涤液中洗涤4次，每次在15ml的1×washbuffer洗涤液中洗涤5分钟，洗涤完毕的结合膜与30ml的平衡液在室温平衡5分钟；

步骤九，化学发光反应：将lightenhrp-b底物液a和lightenhrp-b底物液b按照体积比1∶1混合，在暗室将结合膜从平衡液中取出，放在不吸水的平面，再将发光液均匀覆盖在结合膜表面，将底物液覆盖于结合膜的表面并且反应1-4分钟，然后吸掉底物液并用纸巾从结合膜表面吸走多余的底物液，然后用一张透明纸盖在结合膜表面，其上再盖感光胶片，胶片的曝光时间无法准确决定，每次实验只能多作几张不同曝光度的胶片以获得较佳的图像。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。