本发明属于糖组学分析领域，涉及一种石斛糖组hplc-ms分析方法，具体涉及通过hplc-ms分析石斛o-连接糖组的方法。
背景技术：
石斛为我国传统中药材，其药用价值为人们所共识。经研究发现，多糖是石斛属植物的主要活性成分。然而，目前针对石斛活性成分的研究方法仍主要是“提取→分离→纯化→结构鉴定”的传统方法，糖类活性成分的研究不系统，随机性大、效率低下，至今尚未明确石斛活性糖成分的具体结构。
根据基因组和蛋白质组的定义，糖组应该被定义为单一生物体中的整套聚糖系统。糖组学是继基因组学和蛋白组学后的新兴研究领域，它的研究结果直接关系到是否能够阐明基因功能及细胞功能。不同生物体中的糖组，无法统一，更无法由基因组推测。对糖组的研究最合适的做法是将糖组分解为不同的小组，平林淳和笠井献一的研究组迄今所着眼的是糖蛋白组，而且以线虫的基因组为基础。
目前糖组研究方法较少，糖蛋白为主的糖组学技术问题和发展趋势主要集中于以下四大技术难点：a.糖蛋白分离的问题；b.糖蛋白的基因识别效率较低；c.糖链的结构分析和共价键的确定仍然不是一件容易的工作；d.目前这些糖组研究方法几乎是静态的，而生物体的糖基化过程是动态的。
糖是组成生命体的四大类重要分子之一，糖蛋白质是由糖链与肽链中的特定氨基酸残基以糖苷键共价连接而成的蛋白质。糖蛋白质普遍存在于生物体内，在很多生命过程中起着重要作用，如蛋白质的折叠、细胞之间的相互识别等。同时，糖基化修饰对植物品质的鉴定、活性成分的发现和解析都具有重要意义。以基质辅助激光解吸电离质谱和电喷雾质谱为代表的生物质谱技术，因具有快速、灵敏、可提供结构信息等优点，有望成为糖蛋白质组和糖组分析的重要工具。
蛋白质的糖基化修饰主要有n-糖基化和o-糖基化两种形式。蛋白质o-糖基化是指在蛋白质的ser/thr上起始的黏蛋白型o-糖基化，目前已发现o-连接糖链的异常表达具有重要的生物学意义。然而，由于o-糖基化没有保守的特征修饰序列用来预测糖基化位点，并且没有能够将o-糖链从多肽链上释放下来的通用内切酶，因此目前o-连接糖组研究手段匮乏，目前在糖组学研究领域，仅有个别学者尝试建立了o-连接糖链的糖组学研究方法，并且对o-连接糖链的解析效率较低、通用性差，难以将其用于对石斛进行糖组学研究。
技术实现要素：
针对上述现有技术中石斛o-连接糖组学研究的不足，本发明建立了石斛o-连接糖组的hplc-ms分析方法，通过该方法解析出超过12种的石斛o-连接糖链类型，为石斛活性成分的发现和石斛品质的鉴定提供了有效的检测手段。
一方面，本发明提供一种石斛o-连接糖蛋白糖组hplc-ms分析方法，包括以下步骤：
(1)石斛糖蛋白的提取；
(2)使糖链从蛋白上解离；
(3)固相萃取；
(4)hplc-ms对糖链进行色谱、质谱解析。
本发明所述的石斛o-连接糖蛋白糖组hplc-ms分析方法，其特征在于所述步骤(1)包括取石斛原料粉碎，加入10倍干重的双蒸水，匀浆，70℃浸提12h，离心取上清；沉淀加入10倍干重的双蒸水重复浸提，合并两次浸提的上清即为石斛糖蛋白；将石斛糖蛋白采用sevage法去除游离蛋白，加入无水乙醇至终浓度70％醇析沉淀糖蛋白。
本发明所述的石斛o-连接糖蛋白糖组hplc-ms分析方法，其特征在于所述步骤(2)以10kda滤膜超滤，取截留液加入蛋白变性剂和还原剂56℃孵育1h，再加入等体积的以28％的氨水溶解的硼烷氨络合物混匀，60℃反应24h，以10kda滤膜超滤，取流出液即为石斛蛋白糖链。
本发明所述的石斛o-连接糖蛋白糖组hplc-ms分析方法，其特征在于所述步骤(3)包括将步骤(2)获得的石斛蛋白糖链过hypercarb固相萃取柱(spe)，用含40vt％乙腈和0.05vt％的三氟乙酸的水溶液洗脱获得糖链。
本发明所述石斛o-连接糖蛋白糖组hplc-ms分析方法，其特征在于
步骤(4)中将步骤(3)中获得的糖链上样至hplc柱，采用连续线性梯度洗脱，其流动相a为0.05mph3的醋酸缓冲液，流动相b为分析纯乙腈；第0min，流动相a：流动相b为95：5；第12min，流动相a：流动相b为40:60。
本发明所述石斛o-连接糖蛋白糖组hplc-ms分析方法，其特征在于
步骤(4)中质谱采用四极质谱仪在正离子模式下进行质谱分析。
本发明所述石斛o-连接糖蛋白糖组hplc-ms分析方法，其特征在于
步骤(4)中质谱参数为温度240℃，碰撞能5-20v，质荷比(m/z)为500-2000，数据采集时间1s。
本发明所述石斛o-连接糖蛋白糖组hplc-ms分析方法，其中所述的石斛为铁皮石斛、霍山石斛。
第二方面，本发明还提供所述石斛o-连接糖蛋白糖组hplc-ms分析方法在获得石斛o-连接糖蛋白糖组图谱中的应用。进一步的，本发明还提供利用所述石斛o-连接糖蛋白糖组hplc-ms分析方法获得的石斛o-连接糖蛋白的糖组学图谱。
第三方面，本发明还提供所述石斛o-连接糖蛋白糖组hplc-ms分析方法寻找和发现石斛活性成分中的应用。
第四方面，本发明提供所述方法在鉴定石斛真伪中的用途，包括将待测样本的糖组图谱与石斛标准品糖组图谱进行对比。
本发明取得了以下有益的技术效果：
第一、本发明首次以o-连接糖蛋白糖组的方式研究石斛糖蛋白中的糖类组分，为研究、发现石斛活性成分提供有效的工具。
第二、本发明成功的建立了石斛o-连接糖蛋白糖组的hplc-ms分析方法，所述方法能够解析、分析石斛o-连接糖组，通过本发明的方法首次发现了12种石斛o-连接糖。
第三、本发明所述的方法能显著提高o-糖链的色谱-质谱解析效率，步骤简单、操作方便。
附图说明
图1为石斛o-连接糖蛋白糖组的hplc-ms图。纵坐标轴为intensity(104)，横坐标轴为质荷比(m/z)。结果表明从石斛糖蛋白提取液中成功解析出12种o-糖链。
具体实施方式
还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。
实施例
铁皮石斛糖蛋白的提取
取铁皮石斛干条原料粉碎，加入10倍干重的双蒸水，匀浆，70℃浸提12h，离心取上清；沉淀加入10倍干重的双蒸水重复浸提，合并两次浸提的上清即为石斛糖蛋白；将石斛糖蛋白采用sevage法去除游离蛋白，加入无水乙醇至终浓度70％醇析沉淀糖蛋白。
从糖蛋白上解离o-连接糖链
以10kda滤膜超滤除去糖蛋白提取步骤中的多糖、寡糖、可溶性小分子杂质，弃透过液，取截留液加入蛋白变性剂和还原剂56℃孵育1h，再加入等体积的以28％的氨水溶解的硼烷氨络合物混匀，60℃反应24h，以10kda滤膜超滤除去蛋白成分，取流出液即为石斛糖蛋白上解离下来的o-连接糖链。
固相萃取；
将含有石斛糖蛋白o-连接糖链的超滤透过液过hypercarb固相萃取柱(spe)，用含40％乙腈和0.05％的三氟乙酸(v/v)的水溶液洗脱获得富集后的o-连接糖链。
hplc-ms：
将经过spe富集后的o-连接糖链上样至hplc柱，采用连续线性梯度洗脱，其流动相a为0.05mph3的醋酸缓冲液，流动相b为分析纯乙腈；第0min，流动相a：流动相b为95：5；第12min，流动相a：流动相b为40:60。
将hplc柱与四极质谱仪串联，在正离子模式下进行质谱分析。质谱参数为温度240℃，碰撞能5-20v，质荷比(m/z)为500-2000，数据采集时间1s。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。