本发明涉及血液检测技术领域，尤其涉及一种用于血栓弹力图评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法。
背景技术：
肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的多糖裂解酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又陆续在一些微生物和动物组织中发现存在肝素酶。目前已分离纯化出的肝素酶有三种，分别为肝素酶i、ii、iii，这三种酶的酶学特性各不相同。其中肝素酶i的应用十分广泛，如：清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子肝素、研究肝素的结构等。1948年德国人harter发明了血栓弹力图，80年代开始广泛用于临床指导术中输血，现已成为当今监测凝血功能的最重要指标。血栓弹力图仪能够输出血凝时间r、血凝速率angel及血块强度ma等凝血参数以及纤溶整个过程。将肝素酶与血栓弹力图联合应用便可以检测患者术前及术中血液中肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况。肝素酶i可以降解血液中的肝素，排除肝素干扰检测患者本身的凝血状态。通过与空白对照对比凝血状态便可以评估其肝素效果。但是肝素酶i本身是一种特别容易失活的酶，在没有保护剂的情况下，肝素酶溶液在4℃短期保存即损失大部分活性，而经过一次冷冻融化或一次冻干，则更加大大降低其活性。
目前国内的肝素酶制品存在质量参差不齐，有效期短，稳定性差等问题。在临床检测中会出现因肝素酶失活或不稳定从而误判患者血液中肝素的抗凝效果，导致患者临床手术风险增加。因此，针对以上不足，本发明提供了一种检测评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法。
技术实现要素：
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种检测评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法以解决现有的检测中存在的稳定性差、有效期短、检测准确性差的问题。
(二)技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种评估肝素类药物疗效及残留情况的检测方法，其包括以下步骤：
1.一种评估肝素类药物疗效及残留情况的检测方法，其特征在于：其包括以下步骤：
s1、制备肝素酶溶液；
s2、制备保护剂溶液；
s3、将步骤2中得到的保护剂溶液和步骤1中得到的肝素酶i溶液混合；
s4、将混合试剂冻干和粘附在样品杯的杯底并放置杯盖形成肝素酶杯。
s5、全血样本激活
s6、将肝素酶杯和普通杯(空白样品杯)置于血栓弹力图仪中，向杯中分别加入抗凝剂螯合剂，然后将激活全血样本加入试剂杯中启动血栓弹力图仪开始检测，以获得两个样品杯中血凝块开始的时间。
2.根据权利要求1所述的评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法，其特征在于：步骤s1中所述的酶溶液，以三羟甲基氨基甲烷、磷酸缓冲液、乙酸缓冲液的一种或多种作为溶剂，所述混合试剂的ph值为7.0～9.0，更有选ph＝7.0。
3.根据权利要求1所述的评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法，其特征在于：步骤s2中，所述保护剂溶液主要包括海藻糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、聚乙二醇、醋酸钠、硫酸铵、氯化钠、氯化钙、牛血清白蛋白、人血清白蛋白中的一种或几种，混合溶剂中保护剂质量比为1～15％。更优选海藻糖2％～10％、甘露醇2％～6％、蔗糖1％3％、乳糖1％-3％、聚乙二醇1％-3％、醋酸钠0.1-2％、硫酸铵0.1-2％、氯化钠0.2-1％、氯化钙0.05-1.5％、牛血清白蛋白0.1-5％、人血清白蛋白0.1-5％。以叠氮钠、硫酸庆大霉素、硫柳汞中的之一或其混合作为防腐剂，比例为0.003％～0.1％。
4.根据权利要求3所述的评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法，其特征在于：以三羟甲基氨基甲烷-盐酸、磷酸缓冲液、乙酸缓冲液的一种或多种作为保护剂的溶剂。
5.根据权利要求3所述的评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法，其特征在于：所述保护剂溶液与酶溶液体积比为300～100:1，更优选150～100:1。
6.根据权利要求1所述的评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法，其特征在于：步骤s4中样品杯内衬表面为纹理结构，其中所述平均表面粗糙度ra为之间(大约)5至(约)100纳米，更优选之间(大约)5至(约)80纳米。
7.根据权利要求1所述的评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法，其特征在于：步骤s4中将混合试剂用加样枪分装至样品杯中，并于冻干机中进行抽真空，冷冻干燥；设定冻干机条件为真空度为1-15pa，温度为-40℃至30℃，结束后加盖试剂杯盖。
8.根据权利要求1所述的评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法，其特征在于：步骤s5中全血样本为枸橼酸抗凝全血；枸橼酸钠抗凝全血样本激活方式为取1ml到试剂1瓶中，上下颠倒试剂瓶5次使之充分混匀，静置4分钟激活血液，其中试剂1主要包含高岭土、硅藻土、鞣花酸的一种或几种，比例为0.01％～0.1％。
9.根据权利要求1所述的评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法，其特征在于：步骤s6杯中加入的抗凝剂螯合剂为钙离子，主要包括氯化钙或醋酸钙，摩尔浓度为100mm～500mm,更优选200mm。
10.根据权利要求9所述的评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法，其特征在于，向样品杯中加入步骤s5的全血样本340ul，通过血栓弹力图仪做凝血状态检测。
(三)有益效果
本发明的上述技术方案具有如下优点：本发明提供的评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法中，将肝素酶溶液和保护剂溶液混合配制形成混合试剂，然后将制得的试剂放入样品杯中，对样品杯进行冷冻干燥处理，样品杯在2-8度存储；临床检测过程中，直接拿出底部固定化肝素酶的样品杯，即可通过血栓弹力图仪对全血样本进行测试，可方便地获取液肝素化后凝血状态，该方法操作简便，不需要称量、计算、多次加样等繁琐操作步骤，检测结果不受外界操作干扰，保护剂既能有效保护肝素酶活性，2-8度存储有效期达25个月，又提供肝素酶粘附于样品杯底部，提高样品杯内试剂的稳定性，进而可提高检测结果的稳定性与准确性。
附图说明
图1是本发明实施例评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法中样品杯结构剖视图及正面直观图。
图中，1：样品杯；2：杯盖3：肝素酶。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
如图所示，一种评估肝素类药物疗效及残留情况的检测方法，包括如下步骤：
s1、配制肝素酶溶液和保护剂溶液，并按体积比为1:100～300，更有选1：100～150。
其中，在步骤s1中的肝素酶溶液的酶活性为12,000u/ml，保护剂溶液中主要包含海藻糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、聚乙二醇、醋酸钠、硫酸铵、氯化钠、氯化钙中的一种或几种，混合溶剂中保护剂质量比为1～15％。以叠氮钠、硫酸庆大霉素、硫柳汞中的之一或其混合作为防腐剂，比例为0.003％～0.1％。实施过程：首先配制10-100mm缓冲液，用hcl、醋酸或naoh调整ph7.0～9.0；按照制定比例配制肝素酶溶液(12,000u/ml)；配制保护剂溶液，依次加入盐类物质、固相试剂、蛋白保护剂、氨基酸、表面活性剂、防腐剂，充分溶解均匀。最后将肝素酶按体积比为1：:100～300，更有选1：100～150混合待分装。
其中，缓冲剂：包括三羟甲基氨基甲烷-盐酸、磷酸缓冲液、乙酸缓冲液的一种或多种混合；保护剂：包括海藻糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、聚乙二醇、醋酸钠、硫酸铵、氯化钠、氯化钙、牛血清白蛋白、人血清白蛋白中的一种或几种；
s2.将肝素酶与保护剂混合试剂加样枪分装定量分装在样品杯底部，分装体积为10-50ul；
s3.对s2中样本杯进行冻干，将肝素酶混合试剂粘附在样品杯底，防止干燥后因磕碰或其他外力导致试剂脱落从而增加试剂稳定性；
具体为：将分装好的样品杯与西林瓶直接放置在冻干机托盘中，设定冻干机真空度1-15pa，设定冻干机的冻干曲线，温度范围从-40℃至30℃，冻干曲线的设定为：首先，温度为-40℃，保持时间2-4小时；然后温度为-30℃，保持时间2-6小时；然后温度为-20℃，保持时间2-6小时；然后温度为-10℃，时间为2-4小时；然后温度为0℃，时间为2-4小时；然后温度为10℃，时间为2-4小时；然后温度为20℃，时间为2-4小时；然后温度为30℃保持至结束，结束后加盖试剂杯盖。
s4、在枸橼酸抗凝环境下采集全血样本；
具体为：在步骤s5中的血样本加入枸橼酸抗凝管中保存，枸橼酸抗凝管为蓝色头盖，内添加有枸橼酸钠。枸橼酸钠可与血液中钙离子形成络合物，可延长凝血时间，适用于凝血实验。在枸橼酸抗凝管中取用1ml移液器移取枸橼酸钠抗凝全血样本1ml到试剂1瓶中，上下颠倒试剂瓶5次使之充分混匀，静置4分钟激活血液。
s5.在血栓弹力图仪的两个通道上分别装载一套普通杯(空白试剂杯)和一套肝素酶杯。分别移取20μl氯化钙溶液到普通杯及肝素酶杯杯底。
s6.激活完成后，分别移取340μl试剂1瓶中的血液到普通杯和肝素酶杯中。
s7.将杯子移至测试位置，测试杆拨至“测试”位，点击“开始”或“start”，开始测试。包被在样品杯底部的肝素酶试剂会快速释放与血样充分混匀，所检测的血栓弹力图r值为特异的患者血液中无肝素或肝素被清除后的血凝块生成时间，检测值将与接下来的普通杯检测的血凝块生成时间r值做对比，若血液样本中存在肝素，则肝素酶杯的r值将小于普通杯的r值。
综上所述，本发明评估肝素、低分子肝素以及类肝素药物疗效及残留情况的检测方法，在肝素酶溶液中加入保护剂和防腐剂形成混合试剂，提高了肝素酶的保存时间，肝素酶可有效去除血液中肝素对凝血状态的干扰。该检测方法的肝素酶直接包被粘附在样品杯中，增加了运输、储存的稳定性，同时临床检测时简化了检测流程，只需将激活全血样本加入在样品杯中，减少了误差，增加了检测的稳定性；而且与血样混合后具有很好的扩散效果，使肝素酶在血液中溶解，保证了检测的有效性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。