时空分辨光谱成像系统的制作方法

本发明属于光学显微仪器制造技术及光谱成像技术领域，特别涉及时空分辨光谱成像系统。

背景技术：

金属或半导体纳米材料具有稳定的局域表面等离子体散射性能，因而受到了广泛关注。为了利用该散射光对纳米材料表面的折射率超灵敏响应能力，已有多种暗场显微镜被发展用于研究等离子体纳米探针在化学和生物分析中的应用。目前已有的暗场显微镜主要分为两种：光谱检测型和散射光强检测型。光谱检测型暗场显微镜利用宽带光源及光谱仪对等离子体共振散射光谱进行分析，而散射光强型则利用单波长的激光作为光源对纳米颗粒的在特定波长下的散射截面进行分析。这两种暗场显微镜都有各自的优势和劣势，比如光谱检测型暗场显微镜可以稳定采集单颗粒纳米粒子的散射光谱，但是需要逐个对纳米粒子进行光谱采集，无法同时对多个粒子进行光谱采集，采样通量低，且在生物体系中有很强的散射背景，影响检测灵敏度。散射光强型暗场显微镜避免了生物背景散射的干扰，拥有极高的时间分辨率和灵敏度，但是由于检测的是目标样品在该波长下的散射光强，易受到光源光强的波动、系统机械误差和非对称目标样品方向变化带来的干扰，导致无法精确测得其光谱数据。

技术实现要素：

本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种时空分辨光谱成像系统。

为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

时空分辨光谱成像系统，包括脉冲激光光源系统、显微镜系统、成像模块和图像处理模块；

所述脉冲激光光源系统发射波长在λ1和λ2之间交替变化的脉冲激光光束；

所述显微镜系统和成像模块设置在脉冲激光光源系统的输出光路上；

所述图像处理模块提取成像模块获得的图片，通过对图片散射光强度进行运算处理，获得目标样品的局部表面等离子体共振波长，实现时空分辨光谱成像。

优选地，所述激光光源系统包括波长为λ1的第一入射光源、波长为λ2的第二入射光源和二向色镜，所述第一入射光源的入射光经二向色镜反射与透过二向色镜的第二入射光源的入射光汇聚成一束波长在λ1和λ2之间交替变化的脉冲光束。

优选地，所述时空分辨光谱成像系统还包括波形发生器，所述波形发生器连接所述第一入射光源、第二入射光源和成像模块；所述波形发生器同时向第一入射光源、第二入射光源和成像模块输出三种不同触发信号；其中给第一入射光源、第二入射光源输出的触发信号为一对相位相反、频率同为f1的方波信号，给成像模块输入的触发信号为频率为f2的脉冲信号，所述f2＝2f1。

优选地，所述二向色镜与显微镜系统之间设置有偏振片。

优选地，所述第一入射光源和第二入射光源的入射角度可独立调节。

优选地，所述显微镜系统为全内反射显微镜、透射式暗场显微镜、反射式暗场显微镜、光片显微镜、共聚焦显微镜、内窥镜中任意一种。

优选地，所述图像处理模块将成像模块获得的图片序列拆分成序列1和序列2，所述序列1由目标样品对波长为λ1的光源的散射照片组成，所述序列2由目标样品对波长为λ2的光源的散射照片组成。

所述序列1和序列2的照片通过以下关系式运算生成序列3的照片：

其中

i1表示序列1的照片每个像素点的强度值，

i2表示序列2的照片每个像素点的强度值，

i3表示序列3的照片每个像素点的强度值，单位为nm，即为目标纳米颗粒的局部表面等离子体共振散射波长；

b＝(λ1+λ2)/2，

a＝-c0/k，所述c0为当目标样品局部表面等离子体共振散射波长＝b时的散射截面，所述k为目标样品局部表面等离子体共振散射波长在λ1和λ2之间时，其在λ1或λ2处的散射截面随着局部表面等离子体共振散射波长变化曲线斜率的绝对值。

优选地，目标样品的局部表面等离子体共振散射波长落在λ1、λ2之间。

优选地，所述λ1、λ2选自300nm至2000nm中任意一个值。

优选地，所述f1选自0.01hz到100mhz中任意一个值。

时空分辨光谱成像系统用于检测包括具有局部表面等离子体共振散射性能的纳米颗粒的目标样品。

优选地，时空分辨光谱成像系统用于检测探针细胞内的纳米颗粒的散射光波长信号或者肿瘤组织中的纳米颗粒散射光波长信号。

所述时空分辨光谱成像系统的显微镜系统为全内反射显微镜时，所述脉冲光束经过高数值孔径的油镜，以大于70°的高角度照射样品台；产生高倾斜角度薄层光片(highlyinclinedandlaminatedoptical,简称hilo)；利用hilo照射纳米颗粒产生局部表面等离子体共振散射，该散射光信号被所述油镜采集，进入所述成像模块进行暗场散射成像。

相对于现有技术，本发明的优点如下，

本发明的时空分辨光谱成像系统，通过图像处理模块直接将脉冲激光光束两个波长的散射强度转换成光谱数据，可同时检测到视野中多个目标样品的局部表面等离子体共振散射波长，克服了光谱检测型暗场显微镜采样通量低的缺陷；同时，由于本发明采用激光光源代替宽带白光光源，克服了光谱检测型暗场显微镜在生物体系中有很强的散射背景的缺点；

本发明通过图像处理模块直接将脉冲激光光束两个波长的散射强度转换成局部表面等离子体共振散射波长，而不是像传统的单波长散射光强型暗场显微镜检测的是目标样品在该波长下的散射光强，从而消除了光源光强的波动、系统机械误差和非对称目标样品方向变化带来的干扰；

本发明是一种新型的暗场显微光谱成像手段，相较于目前的暗场显微成像技术有了显著的功能和性能方面的提高：时空分辨光谱成像系统的采集光谱时间分辨率从现有技术中的秒级下降至毫秒级；空间分辨率显著提高，现有技术只能检测光谱仪狭缝中的数个颗粒，而本发明可检测视野中的全部颗粒。

附图说明

图1为实施例1的时空分辨光谱成像系统示意图；

图2为实施例2的时空分辨光谱成像系统示意图；

图3为实施例2的脉冲激光光源系统和成像模块的触发信号图；

图4为实施例3的基于全内反射显微镜的时空分辨光谱成像系统示意图；

图5为实施例3的脉冲激光光源系统和成像模块的触发信号图；

图6为实施例3的金纳米棒的局部表面等离子体共振波长光谱图；

图7为实施例4的热敏聚合物聚异丙烯酰胺修饰的金纳米棒局部表面等离子体共振波长变化曲线；

图中，1是全内反射显微镜，2是第一入射光源，3是第二入射光源，4是成像模块，5是图像处理模块，6是二向色镜，7是金纳米棒。

具体实施方式

实施例1：

如图1，时空分辨光谱成像系统，包括脉冲激光光源系统、显微镜系统、成像模块和图像处理模块；

所述脉冲激光光源系统发射波长在λ1和λ2之间交替变化的脉冲激光光束；

所述显微镜系统和成像模块设置在脉冲激光光源系统的输出光路上；

所述图像处理模块提取成像模块获得的图片，通过对图片散射光强度进行运算处理，获得表示目标样品局部表面等离子体共振波长的图片，实现时空分辨光谱成像。

实施例2：

如图2，时空分辨光谱成像系统，包括波形发生器、脉冲激光光源系统、显微镜系统、成像模块和图像处理模块；

所述激光光源系统包括波长为λ1的第一入射光源、波长为λ2的第二入射光源和二向色镜，所述第一入射光源的入射光经二向色镜反射与透过二向色镜的第二入射光源的入射光汇聚成一束波长在λ1和λ2之间交替变化的脉冲光束；

所述波形发生器连接所述第一入射光源、第二入射光源和成像模块；所述波形发生器同时向第一入射光源、第二入射光源和成像模块输出三种不同触发信号；其中给第一入射光源、第二入射光源输出的触发信号为一对相位相反、频率同为f1的方波信号，给成像模块输入的触发信号为频率为f2的脉冲信号，所述f2＝2f1；

所述第一入射光源和第二入射光源的入射角度可独立调节；

所述显微镜系统和成像模块设置在脉冲激光光源系统的输出光路上；

所述图像处理模块将成像模块获得的图片序列拆分成序列1和序列2，所述序列1由目标样品对波长为λ1的光源的散射照片组成，所述序列2由目标样品对波长为λ2的光源的散射照片组成。

所述序列1和序列2的照片通过以下关系式运算生成序列3的照片：

其中

i1表示序列1的照片每个像素点的强度值，

i2表示序列2的照片每个像素点的强度值，

i3表示序列3的照片每个像素点的强度值，单位为nm，即为目标纳米颗粒的局部表面等离子体共振散射波长；

b＝(λ1+λ2)/2，

a＝-c0/k，所述c0为当目标样品局部表面等离子体共振散射波长＝b时的散射截面，所述k为目标样品局部表面等离子体共振散射波长在λ1和λ2之间时，其在λ1或λ2处的散射截面随着局部表面等离子体共振散射波长变化曲线斜率的绝对值。

其中，目标样品的局部表面等离子体共振散射波长落在λ1、λ2之间，更加优选地，所述λ1、λ2范围可从300nm至2000nm。

所述f1的范围可由0.01hz到100mhz。

实施例3：

同实施例1或2，不同之处在于，时空分辨光谱成像系统的显微镜系统采用全内反射显微镜、透射式暗场显微镜、反射式暗场显微镜、光片显微镜、共聚焦显微镜或内窥镜。

基于全内反射显微镜的时空分辨光谱成像系统如图3，所述脉冲光束经过高数值孔径的油镜，以大于70°的高角度照射样品台；产生高倾斜角度薄层光片(highlyinclinedandlaminatedoptical,简称hilo)；利用hilo照射纳米颗粒产生局部表面等离子体共振散射，该散射光信号被所述油镜采集，进入所述成像模块进行暗场散射成像。

为了获得偏振方向平行的两束光，可在二向色镜与显微镜系统之间设置有偏振片。

用上述基于全内反射显微镜的时空分辨光谱成像系统对金纳米棒的局部表面等离子体共振散射波长进行成像，所采用的λ1＝735nm，λ2＝785nm，f1为50hz，结果如图6，可同时检测出视野中所有金纳米棒的局部表面等离子体共振散射波长(图中λpeak表示局部表面等离子体共振散射波长)。

实施例4：

时空分辨光谱成像系统用于检测包括具有局部表面等离子体共振散射性能的纳米颗粒的目标样品。

用实施例3所述基于全内反射显微镜的时空分辨光谱成像系统检测热敏聚合物聚异丙烯酰胺修饰的金纳米棒的局部表面等离子体共振散射波长，所采用的λ1＝735nm，λ2＝785nm，f1为500hz，采集光谱时间分辨率为2ms，结果如图7，使用激光对表面修饰了热敏聚合物聚异丙烯酰胺的两个金纳米棒进行加热，分别为图中的金纳米棒1，金纳米棒2。金纳米棒的局部表面等离子体共振散射波长在激光加热后(时间为20ms时开始加热)的4ms内发生了红移，且在停止加热后(时间为370ms时停止加热)的4ms内发生了蓝移。

基于上述实验，本发明的时空分辨光谱成像系统可用于检测探针细胞内的纳米颗粒的散射光波长信号或者肿瘤组织中的纳米颗粒散射光波长信号。

需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。