DNAJB6、Hsp70及Hsp90α的组合在Ⅱ期结肠癌预后判断中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学、临床检测技术领域，具体涉及由dnajb6、hsp70及hsp90α构成的标志物组合，以及所述标志物组合在制备ⅱ期结肠癌预后判断和预测复发转移风险标志物试剂盒中的应用。

背景技术：

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，全世界每年约有130万新发病例被确诊。在欧美发达国家，结直肠癌是发病率和死亡率均位居前三位的恶性肿瘤。近年，我国结直肠癌的发病率呈逐年上升趋势。卫生部全国肿瘤防治办公室提供的最新资料显示，结直肠癌分别位居我国恶性肿瘤发病率和死亡率的第三位和第五位，其发病率在城市地区已达第二位。

目前结肠癌的治疗是以手术为主的综合治疗。与单纯手术比较，对ⅲ期结直肠癌患者进行术后辅助化疗能够降低30％～40％的复发率和死亡率，总体5年生存率可以相应提高10％以上。对于ⅱ期结肠癌患者而言，单独手术后总的5年生存率在70％－80％之间。

尽管大部分ⅱ期结肠癌患者预后相对较好，但仍有约25％－30％的患者术后会出现复发并因此死亡。另外，临床常用的一线化疗方案例如folfox、folfiri或capeox，不仅给患者带来可测量的毒副反应，如白细胞、血小板降低等，而且常伴随无法准确测量而又明显降低患者生活质量的症状，如乏力、食欲减退和药物依赖等。

虽然肿瘤分期、分化程度、淋巴结检测数目、错配修复状态、是否化疗对于ii期结肠癌患者预后判断具有提示作用，但是还存在较大争议。而分子改变是结肠癌发生发展的本质因素，有可能更加准确的判断预后，但是由于迄今尚无可以用于准确预测ii期结肠癌患者预后的分子标志物，在已报道的研究结果中，通过辅助治疗提高ⅱ期结肠癌患者无瘤生存率或总生存率的效果尚存在争议。

因此，本领域迫切需要研发出可用于准确预测ⅱ期结肠癌复发风险或准确判断患者预后的分子标志物或分子标志物组合，从而鉴别出可从辅助治疗中获益的ii期结肠癌患者，为其制定合理的个体化治疗方案，从而达到在最大程度上提高这部分患者生存率及改善其生存质量的目的。

技术实现要素：

在本发明中，发明人通过不懈的努力，从大量的癌症标志物蛋白中筛选得到可潜在用于ⅱ期结肠癌预后判断的蛋白标志物组合。所述蛋白标志物组合包括以下三种蛋白，dnajb6、hsp70和hsp90α。本发明人惊奇地发现，该标志物组合能够有效地用于结肠癌特别是ⅱ期结肠癌预后判断，例如生存期或复发风险的判断。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及选自如下的(1)或(2)在制备用于结肠癌特别是ⅱ期结肠癌的诊断、复发风险评估、预后判断或者辅助治疗的药物中的用途，

(1)dnajb6、hsp70和hsp90α的组合；

(2)检测dnajb6、hsp70和hsp90α的试剂。

在本发明的一个实施方案中，所述药物或试剂为dnajb6、hsp70和hsp90α的抗体，或者包含所述抗体的药物组合物；优选地，所述抗体为单克隆抗体。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体还连接有可检测的标记物，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

本发明的另一方面涉及选自如下的(1)或(2)在制备结肠癌特别是ⅱ期结肠癌的诊断、复发风险评估、预后判断或者辅助治疗的药物中的用途，

(1)编码dnajb6、hsp70和hsp90α的核酸的组合；

(2)检测编码dnajb6、hsp70和hsp90α的核酸的试剂。

在本发明的一个实施方案中，所述药物或试剂为特异性检测编码dnajb6、hsp70和hsp90α的核酸序列的引物或者探针，或者包含所述引物或者探针的药物组合物。

在本发明的一个实施方案中，所述探针还连接有可检测的标记物，例如荧光基团；优选为选自cy3、cy5、texasred、6-famtm、af532、af647和af688中的至少一种。

本发明的再一方面涉及一种蛋白标志物组合，其包含dnajb6、hsp70和hsp90α。

本发明还涉及一种检测剂，其包含dnajb6、hsp70和hsp90α的抗体；优选地，所述抗体为单克隆抗体；优选地，所述抗体还连接有可检测的标记物，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

本发明还涉及一种检测剂，其包含特异性检测编码dnajb6、hsp70和hsp90α的核酸序列的引物或者探针；所述探针还连接有可检测的标记物，例如荧光基团；优选为选自cy3、cy5、texasred、6-famtm、af532、af647和af688中的至少一种。

本发明还涉及一种试剂盒，其包含权利要求8或9所述的检测剂。

在本发明的一个实施方案中，检测剂或试剂盒所针对的样品为ⅱ期结肠癌患者的组织样本。

本发明还涉及一种诊断、复发风险评估或预后判断结肠癌特别是ⅱ期结肠癌的方法，包括检测dnajb6、hsp70和hsp90α是否全部为阳性的步骤，例如通过免疫组织化学(ihc)的方法进行检测。在本发明的一个实施方案中，所针对的样品为ⅱ期结肠癌患者的组织样本。当本发明涉及的三种标志物的抗原－抗体反应均呈现阳性时，判断所测ⅱ期结肠癌患者预后较差。

检测蛋白标志物的方法涉及使用其特异性抗体与蛋白质标志物分子相互作用并进行检测。例如可以如本文所述使用针对蛋白标志物的免疫组织化学实验(ihc)试剂(其中包含该蛋白的抗体)。可以使用本领域技术人员熟知的标准技术制备抗体，或者使用商售的抗体。可以使用多克隆抗体，但优选单克隆抗体。

可以使用免疫测定的方法定量检测蛋白标志物的存在。所述免疫测定通常包括将生物样品与抗体一起孵育，并通过熟知技术ihc检测结合抗体。

在本发明的实施方案中，制备样本方法、ihc方法和阳性判断标准如下：

(1)制备样本：

将30min之内的离体手术组织投入中性福尔马林固定液中固定过夜，流水冲洗，经过脱水、透明和浸蜡，制备组织蜡块。以组织病理学判断为ii期结肠癌的病例。每个病例选取3个典型的癌组织点和2个正常的癌旁组织点，制作组织微阵列并制备4μm切片。

(2)ihc：蛋白的具体检测方法如下：

将组织芯片正面迎风置于65℃烘烤箱中烘烤40min，使标本贴附更好，浸入二甲苯洗缸i、ii、iii中，分别置于25℃恒温水浴箱中10min，转入100％、85％、75％乙醇中各3min梯度水化，然后转入pbs缓冲液i、ii、iii中，每次5min，置于3％过氧化氢洗缸中15min，封闭内源性过氧化酶。浸入加热后的枸橼酸钠缓冲液中，微波炉中低火20min。浸入pbs缓冲液i、ii、iii中，每次3min。用pappen免疫组化石蜡笔沿组织芯片边缘画出其范围，将稀释后的一抗溶液或抗体工作液用200μl微量加样器铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育2h或4℃冰箱中过夜。在纸巾上去除多余一抗，将组织芯片依次浸入pbs缓冲液i、ii、iii中，每次3min。加二步法免疫组化检测试剂盒中的试剂ⅱ，确保铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育15min。在纸巾上去除多余试剂，将组织芯片依次浸入pbs缓冲液i、ii、iii中，每次3min。加二步法免疫组化检测试剂盒中的试剂ⅲ(polyperoxidase-anti-mouse/rabbitigg)，确保铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育30min。在纸巾上去除多余试剂，将组织芯片依次浸入pbs缓冲液i、ii、iii中，每次3min。取dab试剂盒取适量试剂，按1mldab稀释液加50μldab浓缩液的比例混匀；用200μl微量加样器将稀释后的dab溶液铺满所画范围内的组织阵列表面进行显色，同一芯片保持显色时间一致；在镜下观察显色效果直至同一芯片内部及不同芯片之间形成较显著的对比后在纸巾上去除多余dab溶液并置于蒸馏水中；显色时间为60s，不同抗体间显色时间有所差异。将苏木素染液用1000μl微量加样器迅速铺满所画范围内的组织阵列表面，10s后用缓慢的流水立刻冲去；将染色后的芯片置于1％氨水中。将组织芯片依次浸入75％、85％、100％乙醇中各3min梯度脱水。浸入二甲苯洗缸中，10min，脱去pappen免疫组化石蜡笔画出的笔迹，将组织芯片置于通风处晾干，用快干封片剂封片。

(3)阳性或阴性的判断标准：

dnajb6、hsp70及hsp90α蛋白单独阳性的判断标准：

计数20个高倍视野的免疫组化反应着色的细胞，染色强度积分为：无染色1分，弱染色2分，中等染色3分，强染色4分；染色面积积分为：着色范围≤10％为0分，>10％－25％为1分，>25％－50％为2分，>50％－75％为3分，>75％为4分。若两者积分乘积≥6分则判断为为阳性，低于6分则为阴性。

标志物组合阳性，ⅱ期结肠癌预后差。

dnajb6、hsp70及hsp90α三个蛋白表达检测结果全部为阳性时，判断该样品中标志物组合检测结果为阳性；当三个蛋白中没有或仅有一个表达为阳性或者仅有任意两个蛋白表达为阳性时，判断该样品中标志物组合检测结果为阴性。

下面是对本发明中涉及的部分术语的解释。

dnajb6属于hsp40家族一员，可以与抗凋亡伴侣蛋白hsp70相结合，激活hsp70的atp酶活性，在结直肠癌中表达升高，可以促进细胞的侵袭。在本发明的一个实施方案中，dnajb6的氨基酸序列请参见genbank登录号np_490647.1，其编码核酸序列请参见nm_058246.3。

hsp70是一种在应激条件下诱导表达的伴侣蛋白，能帮助细胞内新生蛋白折叠，蛋白细胞内运输、蛋白装配和降解，在结直肠癌、肺癌、胃癌等恶性肿瘤中表达升高，可促进肿瘤生长。在本发明的一个实施方案中，hsp70的氨基酸序列请参见genbank登录号np_005336.3，其编码核酸序列请参见nm_005345.5。

hsp90α能与细胞内的一些辅分子伴侣结合，形成各种不同的多蛋白复合体，通过维持其受体蛋白的稳定和活性，调控细胞内多条与细胞增殖、分化、存活以及凋亡有关的信号转导通路。hsp90α蛋白在结直肠癌、肺癌、肝癌和乳腺癌中高表达，并与患者预后相关。在本发明的一个实施方案中，hsp90α的氨基酸序列请参见genbank登录号np_001017963.2，其编码核酸序列请参见nm_001017963.2。

本发明中，如果没有特别说明，所述标志物组合，是指dnajb6、hsp70及hsp90α构成的标志物组合。

i期结肠癌：肿瘤细胞侵犯结肠黏膜下层和固有肌层，而无区域淋巴结转移的结肠癌

ⅱ期结肠癌：肿瘤细胞穿透结肠固有肌层到达浆膜下层，或侵犯无腹膜覆盖的结肠旁组织，或透腹膜脏层或直接侵犯或粘连于其他器官或结构，无区域淋巴结转移的结肠癌。

iii期结肠癌：肿瘤细胞侵犯结肠黏膜下层和固有肌层，或穿透结肠固有肌层到达浆膜下层，或侵犯无腹膜覆盖的结肠旁组织，或透腹膜脏层或直接侵犯或粘连于其他器官或结构，并且存在区域淋巴结转移的结肠癌。

本发明中，术语“预后”具有本领域技术人员知悉的含义。在本发明的一个实施方案中，预后是指无病生存时间和/或无复发转移时间。其中，如果对象是一个群体(2个或2个以上患者)，预后是指中位无病生存时间和/或中位无复发转移时间。

在本发明的一个实施方案中，所述无病生存时间或中位无病生存时间为45个月。在本发明的一个实施方案中，所述无复发转移时间或中位无复发转移时间为60个月。在本发明的一个实施方案中，所述无病生存时间或中位无病生存时间为72个月。在本发明的一个实施方案中，所述无复发转移时间或中位无复发转移时间为73个月。

当dnajb6、hsp70及hsp90α的标志物组合阳性时，ⅱ期结肠癌患者的无病生存时间或中位无病生存时间为45个月，和/或，无复发转移时间或中位无复发转移时间为60个月。当dnajb6、hsp70及hsp90α的标志物组合阳性时，ⅱ期结肠癌患者的无病生存时间或中位无病生存时间为72个月，和/或，无复发转移时间或中位无复发转移时间为73个月。

发明的有益效果

本发明利用特异性抗体联合检测样品中的dnajb6、hsp70和hsp90α蛋白的表达情况，可以针对ⅱ期结肠癌患者(个人或者群体)进行较为准确的预后判断，其准确性显著高于使用单一蛋白标志物的检测结果。同时，本发明检测结果有助于临床医生为ⅱ期结肠癌患者制定更为合理的治疗方案，包括确定随诊的频率，选择合适的治疗方式及治疗药物，因而在改善患者的治疗效果并提高患者的生存率方面有潜在应用价值。

附图说明

图1：dnajb6、hsp70和hsp90α蛋白在ii期结肠癌及癌旁正常组织(normal)中的表达情况(示例)。

图2a：dnajb6表达与ⅱ期结肠癌患者总生存的关系。针对的是ⅱ期结肠癌蜡块组织样本，纵坐标为ⅱ期结肠癌患者存活率。

图2b：hsp70表达与ⅱ期结肠癌患者总生存的关系。针对的是ⅱ期结肠癌蜡块组织样本，纵坐标为ⅱ期结肠癌患者存活率。

图2c：hsp90α表达与ⅱ期结肠癌患者总生存的关系。针对的是ⅱ期结肠癌蜡块组织样本，纵坐标为ⅱ期结肠癌患者存活率。

图2d：标志物组合表达与ⅱ期结肠癌患者总生存的关系。针对的是ⅱ期结肠癌蜡块组织样本，纵坐标为ⅱ期结肠癌患者存活率。

图3a：dnajb6表达与ⅱ期结肠癌患者复发转移的关系。针对的是ⅱ期结肠癌蜡块组织样本，纵坐标为ⅱ期结肠癌患者复发转移率。

图3b：hsp70表达与ⅱ期结肠癌患者复发转移的关系。针对的是ⅱ期结肠癌蜡块组织样本，纵坐标为ⅱ期结肠癌患者复发转移率。

图3c：hsp90α表达与ⅱ期结肠癌患者复发转移的关系，针对的是ⅱ期结肠癌蜡块组织样本，纵坐标为ⅱ期结肠癌患者复发转移率。

图3d：标志物组合表达与ⅱ期结肠癌患者复发转移的关系。针对的是ⅱ期结肠癌蜡块组织样本，纵坐标为ⅱ期结肠癌患者复发转移率。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在本发明中，

检测dnajb6的抗体购及测试剂订制于abcam(英国)公司，货号为ab198995；

检测hsp70和hsp90α使用的抗体购自proteintechgroup，inc(中国)公司，货号分别为10995-1-ap和60318-1-ig；

免疫组化二抗试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司，货号为pv-9000。

在本发明中，ihc方法和阳性判断标准如下：

(1)ihc：各蛋白的具体检测方法如下：

将组织芯片正面迎风置于65℃烘烤箱中烘烤40min，使标本贴附更好，浸入二甲苯洗缸i、ii、iii中，分别置于25℃恒温水浴箱中10min，转入100％、85％、75％乙醇中各3min梯度水化，然后转入pbs缓冲液i、ii、iii中，每次5min，置于3％过氧化氢洗缸中15min，封闭内源性过氧化酶。浸入加热后的枸橼酸钠缓冲液中，微波炉中低火20min。浸入pbs缓冲液i、ii、iii中，每次3min。用pappen免疫组化石蜡笔沿组织芯片边缘画出其范围，将稀释后的一抗溶液或抗体工作液用200μl微量加样器铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育2h或4℃冰箱中过夜。在纸巾上去除多余一抗，将组织芯片依次浸入pbs缓冲液i、ii、iii中，每次3min。加二步法免疫组化检测试剂盒中的试剂ⅱ，确保铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育15min。在纸巾上去除多余试剂，将组织芯片依次浸入pbs缓冲液i、ii、iii中，每次3min。加二步法免疫组化检测试剂盒中的试剂ⅲ，确保铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育30min。在纸巾上去除多余试剂，将组织芯片依次浸入pbs缓冲液i、ii、iii中，每次3min。取dab试剂盒取适量试剂，按1mldab稀释液加50μldab浓缩液的比例混匀；用200μl微量加样器将稀释后的dab溶液铺满所画范围内的组织阵列表面进行显色，同一芯片保持显色时间一致；在镜下观察显色效果直至同一芯片内部及不同芯片之间形成较显著的对比后在纸巾上去除多余dab溶液并置于蒸馏水中；显色时间为60s，不同抗体间显色时间有所差异。将苏木素染液用1000μl微量加样器迅速铺满所画范围内的组织阵列表面，10s后用缓慢的流水立刻冲去；将染色后的芯片置于1％氨水中。将组织芯片依次浸入75％、85％、100％乙醇中各3min梯度脱水。浸入二甲苯洗缸中，10min，脱去pappen免疫组化石蜡笔画出的笔迹，将组织芯片置于通风处晾干，用快干封片剂封片。

(2)阳性或阴性的判断标准：计数20个高倍视野的免疫组化反应着色的细胞，染色强度积分为：无染色1分，弱染色2分，中等染色3分，强染色4分；染色面积积分为：着色范围≤10％为0分，>10％－25％为1分，>25％－50％为2分，>50％－75％为3分，>75％为4分。若两者积分乘积≥6分则为阳性，低于6分则为阴性。

实施例1：蛋白标志物组合表达水平在判断ⅱ期结肠癌患者总生存期中的研究

(1)针对通过病理学检测确诊的102例ⅱ期结肠癌患者的肿瘤组织样本，使用上述的ihc方法检测dnajb6、hsp70和hsp90α三个蛋白的表达水平，并判断阳性还是阴性。检测结果和患者的相关数据如下面的表1所示。

表1：dnajb6、hsp70和hsp90α在ii期结肠癌中的表达情况

上面的表1中：

p值用斜体标出。

根据结肠肿瘤细胞分化程度可对肿瘤进行病理分级：ⅰ级为分化好，恶性程度低；ⅱ级为分化中等，恶性程度中度；ⅲ级为分化差，恶性程度高。＞95％腺管形成的结直肠癌为高分化结直肠癌，50％－95％腺管形成的结直肠癌为中分化结直肠癌，0－49％腺管形成的结直肠癌为低分化结直肠癌。

tnm分期：t：tumor(topography)，代表原发肿瘤的范围；n：lymphnode，代表区域淋巴结转移的存在与否及范围；m：metastasis，代表远处转移的存在与否。三个大写字母后可分别通过接数字或小写字母来对原发部位、淋巴结转移及远处转移的情况作表达。根据ajcc分期第八版进行分期。

美国国立综合癌症网络(nccn)指南推荐结肠癌患者至少要检测12个淋巴结，对n0期结肠癌患者，检测淋巴结数小于12个者视为高危因素。对手术中的淋巴结进行切除，福尔马林保存，送至病理科进行包埋，he染色。

定位将结肠分为左半结肠和左半结肠两部分，其中左半结肠包括乙状结肠、降结肠、横结肠脾曲、左半横结肠，右半结肠包括升结肠、横结肠右半部。

部分病例的ihc检测结果如图1所示。从图1可以看出，dnajb6、hsp70和hsp90α三个蛋白在ⅱ期结肠癌组织中的水平高于癌旁正常组织。

(2)结合表1中的数据以及患者的总生存期数据(表2)，进行单因素和多因素方差分析。

表2：患者的总生存期数据以及复发转移数据

kaplan-meier法单因素生存分析的具体方法：首先计算出存活时间超过一定时期的病人再活过下一时期的概率(即生存概率)，然后将逐个生存概率相乘，即为相应时段的生存率。

多因素cox回归分析的具体方法：目的是处理多因素生存分析数据，寻找影响生存状况的危险因素。建议纳入cox回归模型的变量有：1)单因素分析差异有统计学意义的变量；2)单因素分析时，没有发现差异有统计学意义，但是临床上认为与因变量关系密切的自变量。

总生存期的cox回归分析结果见表3。总生存期是指从随机化开始至因任何原因引起死亡的时间。

表3：ii期结肠癌总生存的单因素和多因素分析

表3显示了dnajb6、hsp70和hsp90α蛋白表达与ⅱ期结肠癌各临床参数之间的关系。

单因素分析结果显示，hsp90α高表达时，患者预后总生存期较短(p＝0.040)，而dnajb6、hsp70和hsp90α标志物组合阳性时，可以更好地将生存期较短的患者区分出来(p＝0.01，表3和图2a-图2d)。

多因素回归分析的结果显示，单个蛋白的阳性表达均不是ii期结肠癌患者的独立预后因子，但是它们同时阳性表达可作为判断ii期结肠癌患者总生存期的独立预后因子(p＝0.006)，其p值低于临床上常用的t分期、分化程度、错配修复状态、化疗等预后判断标准。

从表3可以看出，在ⅱ期结肠癌中，dnajb6的阳性表达与病理分级呈正相关，而与其它临床病理参数无相关性；而hsp70和hsp90α的表达高低均与临床病理参数无关。

实施例2：蛋白标志物组合阳性表达在判断ⅱ期结肠癌患者复发转移中的研究

结合前面实施例1中的表1中的数据以及患者的复发转移数据(表2)，进行单因素和多因素方差分析。

kaplan-meier法单因素生存分析的具体方法：首先计算出存活时间超过一定时期的病人再活过下一时期的概率(即生存概率)，然后将逐个生存概率相乘，即为相应时段的生存率。

多因素cox回归分析的具体方法：目的是处理多因素生存分析数据，寻找影响生存状况的危险因素。建议纳入cox回归模型的变量有：1)单因素分析差异有统计学意义的变量；2)单因素分析时，没有发现差异有统计学意义，但是临床上认为与因变量关系密切的自变量。

复发转移的cox回归分析结果见表4。

表4：ii期结肠癌复发转移的单因素和多因素分析

单因素分析结果显示，dnajb6高表达指示患者复发转移时间较短(p＝0.026)。而联合分析dnajb6、hsp70和hsp90α标志物组合的表达情况，则可以更好地将患者区分为复发转移时间长和短的两组(p<0.001)(图3a－图3d和表4)，判断复发转移时间长短。

多因素回归分析结果显示，三个蛋白独自表达时都不是判断复发转移时间长短的独立预后因子，而作为标志物组合共表达时，可以作为结肠癌患者的独立预后因子(p<0.001)，其p值低于临床上常用的t分期、分化程度、错配修复状态、放化疗等预后判断标准。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。