阿尔茨海默相关神经丝蛋白检测试剂盒及其制备方法与流程

技术领域：

本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，具体地说是一种能够快速准确的对阿尔茨海默相关神经丝蛋白进行定量分析的阿尔茨海默相关神经丝蛋白检测试剂盒及其制备方法。

背景技术：
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阿尔茨海默病(alzheimerdisease，ad)，又叫老年痴呆症，临床上对阿尔茨海默病的诊断较为繁琐。阿尔茨海默相关神经丝蛋白(ad7c-ntp)是一种既能反应ad的病理特点又具有较高的敏感性和特异性的检测方式，能为ad的早期诊断提供客观指标，帮助识别患病人群，筛查出高度怀疑为ad的患者，加快ad诊断进程，增加诊断效率。

阿尔茨海默病相关神经丝蛋白(ad7c-ntp)是一种在神经元胞体中表达的分子量约41kda的跨膜磷蛋白。ad的两大主要病理特征是脑内细胞外β淀粉样肽(amyloidpeptide，aβ)沉积形成的老年斑和细胞内大量异常磷酸化的tau蛋白(p-tau)聚集形成的神经元纤维缠结(neurofibrillarytangle，nft)。1996年麻省总医院的delamonte教授发现，ad7c-ntp在ad脑内表达水平升高，与tau-1共存，与p-tau水平正相关，且出现在组织学尚完整的变性神经元中，证明异常ad7c-ntp蛋白表达增加是ad神经变性的早期事件。随后大量研究表明ad7c-ntp存在于nfts中，主要与诱发神经炎症及细胞死亡有关。

尿液中ad7c-ntp的分子质量与脑脊液和脑组织中相同，并且检测结果相似，尿标本易于获得，病人依从性好，适于用在人群筛查、早期诊断和疗效的观察，能够长期、反复地追踪检查，而且价格较低，能够降低医疗费用，产生重大的社会效益和经济效益，实现了从基础医学向临床医学的转化。

有关ad7c-ntp的最早研究来自于美国麻省总医院癌症中心的charlestown-查尔斯敦博士，他认为：目前临床上ad的确诊需经过尸体脑组织的病理解剖，患者生前的确诊，因缺乏可靠的生化检测手段而无法得到。apoe4等位基因是ad的一个高危因素，但仍有36％的ad患者并无此等位基因。研究发现ad患者脑脊液中β淀粉样蛋白(amyloidβ-rotein)降低，tau蛋白升高，而非ad患者β淀粉样蛋白水平高，tau蛋白水平低。但是，仍有一部分人群这两个指标同时升高或降低。

据报道脑脊液中ad7c-ntp(neuronalthreadprotein)的测定有助于ad的诊断。ad7c-ntp存在于神经细胞发出的轴突中；并且大量存在于ad患者脑中的神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles，nft)中。ad7c-ntp参与脑神经元的修补与再生，ad患者脑中ad7c-ntp基因表达水平异常增高。ad7c-ntp已被确定为诊断ad的生化指标，在ad患者的脑组织和脑脊液中都选择性升高。最新的研究发现，ad患者尿样中ad7c-ntp水平的检测与csf中ad7c-ntp的检测具有同样的意义。

免疫分析技术是利用微量抗原与相应的高特异性抗体之间的免疫反应，来检测如激素、药物、蛋白质、多肽、酶、肿瘤相关抗原、微生素、病毒、细菌及金属元素等生物体内活性物质。免疫分析技术包括标记免疫分析、非标记免疫分析和仪器免疫分析。本试剂盒利用的含有稀土元素的羧基乳胶微球标记免疫分析技术是属于标记免疫分析之一种。

荧光免疫分析(fia)和放射免疫分析(ria)自问世以来，经历了几十年的发展，但是人们越来越感觉到fia因自然本地太高，干扰检测结果；ria采用同位素标记，对人体有极大危害并给实验带来不便。酶免疫分析(eia)也因酶本身不稳定，受其他影响因素较大，推广应用受到限制。80年代初，人们开始研究用稀土元素代替荧光物质和同位素标记蛋白质或抗体，将时间分辨技术引入到生物检测领域，建立了新型的超微量时间分辨荧光免疫分析技术(timeresolvedfluoroimmunoassay，简称trfia)。该技术采用多学科先进技术，集结了其他免疫分析的特点，在免疫学、分子生物学、细胞学和医学等领域，取得长足的发展和广泛应用。

trfia利用了具有独特荧光特性的3价稀土离子及螯合物为示踪物代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系(如抗原抗体反应、核酸探针杂交、生物素亲和素反应以及靶细胞对效应细胞的杀伤效应等)发生后，用trfia检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。在通常的荧光测定中，由于测试样品中含有多种荧光成分，背景荧光(来自样品中的胶体颗粒和溶剂分子引起的散射光以及血清中蛋白质和其他化合物发出的非特异性荧光)强度大、干扰强，成为荧光分析法大范围推广的瓶颈。trfia之所以能够成为继eia、ria之后一种新的灵敏的检测方法，主要取决于镧系元素独特的荧光特点、检测中采用的波长分辨和时间延迟技术以及解离-增强技术。

镧系元素(lanthanide,ln)属于稀土元素，共有17中，常用于trfia主要有铕(eu)、钐(sm)、铽(tb)、镝(dy)。镧系元素具有独特的荧光发光特点，与普通荧光相比，镧系离子螯合物荧光衰变时间长，为传统荧光的10³-10⁶倍。如镧系离子螯合物的荧光衰变时间在60-900μs，常用的eu³⁺荧光衰变时间为714μs，普通荧光免疫分析中荧光团的荧光衰变时间只有1-100μs，样品中一些蛋白质的荧光衰变时间仅为1-10μs，因此利用时间分辨技术，延迟一定时间后测量，便可获得eu³⁺特异性荧光信号。同时由于衰变时间长，eu³⁺标记物在测量时间里可以反复被激发，每次激发后由激发态很快跃迁到基态，就有荧光发出，然后又可被重新激发，如此每秒可有1000次激发，使得trfia荧光标记物的相对比活性很高。镧系元素荧光光谱的最大特征是激发光与发射光之间的stokes位移较大，eu³⁺激发波长为337nm，发射波长为615nm，stokes位移可达278nm；同时eu³⁺被激发的荧光光带极窄，荧光的发射峰非常尖锐，可使仪器调整在极窄的波长范围内测定，这样就几乎完全消除了背景荧光的干扰，继而通过时间延迟和波长分辨，将强特异性荧光和背景荧光辨开(故称为时间分辨)，使干扰达到几乎为零。

鉴于以上标记方法及检测技术的应用，本试剂盒具有良好的检测特异性、较高的灵敏度、操作的简便性以及稳定的荧光标记物保证了检测的准确性。

技术实现要素：
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本发明针对现有技术中存在的缺点和不足，提出了一种利用荧光免疫层析的灵敏性，结合荧光免疫层析分析仪实现的灵敏度高、快捷简便，可以准确定量的阿尔茨海默相关神经丝蛋白检测试剂盒及制备方法。

本发明可以通过以下措施达到：

一种阿尔茨海默相关神经丝蛋白检测试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：pvc板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗原表位的单克隆抗体细胞株。

本发明所述结合垫的稀土荧光微球的直径优选是90-110nm；所述稀土荧光微球优选掺杂有稀土镧系元素，为铕(eu)、钐(sm)、铒(er)、钕(nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物；所述稀土荧光微球优选掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体优选来源于针对3个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。

本发明所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于200mmtris-hcl处理液中(含1.5％tritonx-100，1.5％bsa，ph7.5)，4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜在bio-dotxyz3050三维喷点平台上，用bio-jetquanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时后制得。

本发明中结合垫上的所述稀土荧光微球标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体采用如下步骤制得：

步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：参照阿尔茨海默相关神经丝蛋白氨基酸序列，选择抗原性强的位点人工合成20个氨基酸左右的多肽序列，交联到klh上，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，将所获得的细胞株对应的单克隆抗体进行配对实验和亲和力测定实验，根据实验结果确定捕获抗体和检测抗体；

步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化用于检测的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；

步骤3：稀土荧光微球的醛基化：取3mg稀土荧光微球，用50mm，ph9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为5分钟，最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中，加入300μl醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；

步骤4：稀土荧光微球标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体的制备：将2mg用于检测的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度10mm，4℃反应4小时；再加入等体积的封闭液(100mmtris-hcl，ph7.5，含2％bsa，5％蔗糖)，4℃封闭过夜；然后用100mmtris-hcl，ph7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100μl的100mmtris-hcl缓冲液中(含1.2％nacl，0.5％bsa，0.2％tween20)，4℃避光保存备用。

本发明所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜通过以下步骤制得：

步骤1：根据前述配对实验和亲和力测定实验，选择用于捕获的抗体对应的单克隆抗体细胞株，按照标准的腹水生产工艺制备并纯化用于捕获的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体，保存于-20℃备用；

步骤2：分别用包被稀释液将阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体和羊抗小鼠igg抗体调整浓度到1-5mg/ml，膜液量为1-2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

本发明所述样品垫通过以下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于含有2.0％tritonx-100，2％bsa，0.1mtris缓冲液，ph7.5的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

本发明还提供了一种如上所述试剂盒实现的阿尔茨海默相关神经丝蛋白制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1：将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；

步骤2：精确吸取100μl尿液样本，15-30分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果；

步骤3：设置好荧光免疫层析分析仪的相关参数后，将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果，所述荧光免疫层析分析仪是一种光学检测系统，对阿尔茨海默相关神经丝蛋白的检测范围为0.25-10ng/ml。

本发明提供一种利用稀土荧光免疫层析技术制备的阿尔茨海默相关神经丝蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒，适合尿液样本，并适合临床上单人份检测，相对于阿尔茨海默相关神经丝蛋白定性胶体金试剂，能定量检测样本中的阿尔茨海默相关神经丝蛋白含量，具有更明确的临床指导意义，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

附图说明：

附图1是本发明中试纸卡的结构示意图。

附图2是本发明中实施例2的准确度分析结果示意图。

附图标记：pvc板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫5。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明：

如附图1所示，本发明首先提出了一种阿尔茨海默相关神经丝蛋白检测试剂盒，盒内设有试纸卡，所述试纸卡由下至上依次设有：pvc板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，其中结合垫3上吸附有稀土荧光微球标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗原表位的单克隆抗体细胞株；

所述结合垫3的稀土荧光微球的直径优选是90-110nm；所述稀土荧光微球优选掺杂有稀土镧系元素，为铕(eu)、钐(sm)、铒(er)、钕(nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物；所述稀土荧光微球优选掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体优选来源于针对3个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。

实施例1：

阿尔茨海默相关神经丝蛋白检测试剂盒中试纸卡的各组成部分可以通过以下措施制得：

1、样品垫2的制备：

将玻璃纤维膜浸泡于含有2.0％tritonx-100，2％bsa，0.1mtris缓冲液，ph7.5的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

2、吸附荧光微球标记抗体的结合垫3的制备：

将玻璃纤维膜浸泡于200mmtris-hcl处理液中(含1.5％tritonx-100，1.5％bsa，ph7.5)，4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用。将玻璃纤维膜在bio-dotxyz3050三维喷点平台上，用bio-jetquanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时，备用；

稀土荧光纳米微球的醛基化：取3mg稀土荧光纳米微球，用50mm，ph9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为5分钟，最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中，加入300μl醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；

稀土荧光纳米微球标记阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体的制备：将2mg用于检测的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度10mm，4℃反应4小时；再加入等体积的封闭液(100mmtris-hcl，ph7.5，含2％bsa，5％蔗糖)，4℃封闭过夜；然后用100mmtris-hcl，ph7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100μl的100mmtris-hcl缓冲液中(含1.2％nacl，0.5％bsa，0.2％tween20)，4℃避光保存备用；

3、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜4的制备：

根据前述配对实验和亲和力测定实验，选择用于捕获的抗体对应的单克隆抗体细胞株，按照标准的腹水生产工艺制备并纯化用于捕获的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体，保存于-20℃备用；

分别用包被稀释液将阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体和羊抗小鼠igg抗体调整浓度到1-5mg/ml，膜液量为1-2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时；

试纸卡的组装：在pvc板1上依次粘贴经过处理的样品垫2、吸附有稀土荧光标记的抗体的结合垫3、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜4和吸水垫5，组装后得到试纸大板，按照要求切割成4mm宽，将试纸装入塑料卡内形成试纸卡。

上述各步骤中选用的设备及原料优选以下原料：

阿尔茨海默相关神经丝蛋白特异性配对抗体；阿尔茨海默相关神经丝蛋白质控品：英国朗道实验诊断有限公司；稀土荧光微球：上海甄准生物科技有限公司；硝酸纤维素(nc)膜：millipore公司产品；牛血清白蛋白(bsa)，聚乙二醇peg20000，水解酪蛋白：sigma产品，其它常用试剂均为分析纯试剂。

实施例2：准确度试验

选用上述试纸卡以及荧光免疫层析分析仪(型号：neo-007)，荧光免疫分析仪参数的设定：在荧光免疫分析仪上设定好试纸卡工艺参数后，取上述组装好的试纸卡，分别用0.2、0.5、1、2、5、10ng/ml的阿尔茨海默相关神经丝蛋白校准品，用试纸卡进行测定，得到各校准品的荧光强度值，将结果输入到分析仪的参数中，完成分析仪的参数的设定。

主要检测材料：临床样本由相关医院获得，共200份roche电化学发光免疫法定值尿液样本100份，阿尔茨海默相关神经丝蛋白含量分布区间为0.25-10ng/ml之间。

制备方法：

步骤1：将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；

步骤2：精确吸取100μl样本，加入到样本孔中，15-30分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果；

步骤3：设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果。

试验结果分析：

临床样本检测试剂制备完成后，按制备方法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果。

试验结果：

如附图2所示，以实验系统的检测值为y轴，以对照系统的测验值为x轴，绘制散点图，并进行相关性分析。临床样本检测对200份临床定值样本检测，样本平均偏差值均小于10％，最大偏差小于25％，r2>0.98，一致性系数>0.90。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好，适合用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需要。

实施例3：精密度试验

采用实施例2的试纸卡和测量系统，对本发明的试纸卡和荧光免疫层析分析仪进行精密度实验。

主要检测材料：临床样本由相关医院获得，共2份化学发光免疫法定值尿液样本，其中低值定值样本临床测量值为1ng/ml，高值定值样本临床测量值为6.78ng/ml。

制备方法：

采用实施例2的试纸卡和测量系统，对2份定值样本各进行重复测定20次。

试验结果分析：

临床样本检测试剂制备完成后，按制备方法对临床样本进行检测，并分析检测结果。

试验结果：

对临床测量值为1ng/ml的低值定值样本和临床测量值为6.78ng/ml的高值定值样本重复测定20次后计算平均值，标准差和cv，所得结果显示用本发明的实验系统测试低值定值样本cv为8.13％，测试高值定值样本cv为5.61％。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好，适合用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需要。

本发明提供一种利用稀土荧光免疫层析技术制备的阿尔茨海默相关神经丝蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒，同时适合血清和全血样本，并适合临床上单人份检测，相对于阿尔茨海默相关神经丝蛋白定性胶体金试剂，能定量检测样本中的阿尔茨海默相关神经丝蛋白含量，具有更明确的临床指导意义，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。