挥发性液体的处理方法及液体处理装置与流程

本发明涉及使用空气置换式的活塞式移液管的挥发性液体的处理方法、以及执行该处理方法的液体处理装置。

背景技术：

在物理和化学实验中，为了量取并分注液体，广泛使用空气置换式的活塞式移液管。活塞式移液管具有能够通过使活塞在筒内上下移动而使空气在筒内出入的结构，通过调节使活塞上下移动的距离，能够在安装于筒的前端的吸头内准确地量取液体。

电动操作活塞式移液管的装置也在各公司被销售，这种装置能够进行连续吸入、连续排出。作为这种自动分注装置，有agilent公司的bravo、affymetrix公司的nimbus、eppendorf公司的epmotion、hamilton公司的microlab、beckmancoulter公司的biomak等。

活塞式移液管由于是通过使空气出入来测量液体的构造，因此对于挥发性低的水等液体，能够进行准确测量，而对于乙腈(acn)、丙酮等挥发性高的液体，存在如下问题：在吸入后容易从吸入/排出口发生漏液，难以进行准确测量。作为其理由，可以认为，从吸入/排出口吸入了挥发性高的液体时，因该挥发性液体的蒸气而使移液管的筒内压变化、或因蒸发所产生的汽化热而使筒内的温度变化，从而筒内存在的空气膨胀，将挥发性液体挤出。这也在非专利文献1中公布。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：第82次日本分析化学会有机微量分析研究论坛会-第98次计量自动控制学会力学量计量部会联合研讨会(第32次演讲材料)主题：关于利用微型移液管的分注操作(日文：第82回日本分析化学会有機微量分析研究懇談会·第98回計測自動制御学会力学量計測部会合同シンポジウム(第32回発表資料)テーマ：マイクロピペットを利用した分注操作について)

非专利文献2：https://ocw.kyoto-u.ac.jp/ja/faculty-of-agriculture-jp/5129000/pdf/03.pdf

非专利文献3：https://www.aandd.co.jp/adhome/pdf/tech_doc/analytical/pipette_guide.pdf

技术实现要素：

发明要解决的问题

如上所述，利用移液管等处理挥发性液体的情况下，发生如下现象：在吸入时因液体挥发而使吸头、筒内的空气层膨胀，压力升高，液体被向外挤出。该现象被称为漏液或滴液。由此，液体的准确测量变得无法进行。

作为用于减小由挥发性液体的挥发造成的影响的方法，也提出了：在挥发性液体的测量前，反复多次进行该液体的吸入和排出，用挥发的液体分子使空气层饱和(参照非专利文献2及3。)。但是，在采用这种方法的情况下，虽然能够降低自吸入/排出口的漏液速度，但无法完全消除漏液。

另外，上述方法故意使测量对象的液体挥发而使筒内的空气层饱和，因此存在测量对象的液体量因蒸发而减少的问题。例如如果是测量对象的液体量存在500μl的情况下，即使挥发2μl左右而成为498μl，该减少量为4％左右，也可以说影响较小。但是，测量对象的液体仅存在例如5μl等微量的情况下，5μl之中挥发2μl左右而成为3μl时，约40％的液体减少，影响变得非常大。

因此，特别是在处理仅几μl那样的微量的挥发性液体的情况下，无法采用上述方法。

于是，本发明的目的在于，抑制由挥发性液体的挥发导致的自移液管的漏液。

用于解决问题的方案

本发明的处理方法为一种使用移液管的挥发性液体的处理方法，所述移液管具备筒、在前述筒内滑动的活塞、以及具有吸入/排出口且安装于前述筒的前端的吸头，且根据前述活塞的操作而进行液体从前述吸头的前述吸入/排出口的吸入和排出。该处理方法包括以下的步骤。

低挥发性液体吸入步骤，从前述吸入/排出口吸入挥发性比前述挥发性液体低的低挥发性液体；

空气吸入步骤，在前述低挥发性液体吸入步骤后，从前述吸入/排出口吸入空气；以及，

挥发性液体吸入步骤，在前述空气吸入步骤后，从前述吸入/排出口吸入前述挥发性液体。

本发明的液体处理装置为以使用移液管来执行上述处理方法的方式构成的装置，具备：移液管，其具备沿铅直方向配置的筒、在前述筒内沿上下方向滑动的活塞、以及在前端具有吸入/排出口且以该吸入/排出口朝向下方的方式安装于前述筒的下端的吸头，且根据前述活塞的操作而进行液体从前述吸头的前述吸入/排出口的吸入和排出；驱动机构，其用于对前述移液管进行操作；挥发性液体容器，其容纳有挥发性液体；低挥发性液体容器，其容纳有挥发性比前述挥发性液体低的低挥发性液体；以及，控制部，其用于控制前述驱动机构。前述控制部以在利用前述移液管吸入前述挥发性液体的过程中控制前述驱动机构来执行如下操作的方式构成：低挥发性液体吸入操作，从前述低挥发性液体容器吸入预设量的前述低挥发性液体；空气吸入操作，在前述低挥发性液体吸入操作后从前述吸入/排出口吸入预设量的空气；以及，挥发性液体吸入操作，在前述空气吸入操作后从前述挥发性液体容器吸入规定量的前述挥发性液体。

本发明中的低挥发性液体是指，沸点为95℃以上、且在常温(20℃±15℃)下为液体状态的物质。作为这种低挥发性液体，例如可列举出水、二甲基亚砜、甘油、苯酚、甲苯。

本发明中的挥发性液体是指，沸点为50～95℃的范围内、且在常温(20℃±15℃)下为液体状态的物质、或以10％以上包含这种物质的液体。作为沸点为50～95℃的范围内、且在常温(20℃±15℃)下为液体状态的物质，可列举出例如乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、甲苯、异丙醇、己烷、丁醇、环己烷、乙二醇、苯、氯仿、乙醛、三乙胺、苯酚、萘、甲醛、四氢呋喃、乙酸乙酯。

发明的效果

本发明的挥发性液体的处理方法中，在进行挥发性比挥发性液体低的低挥发性液体和空气的吸入(以下称为预吸入。)之后吸入挥发性液体，因此与不进行预吸入的情况相比，在被吸入到移液管中的挥发性液体的上侧存在的空气层的体积变小。由此，起因于挥发性液体的挥发而膨胀的空气层的膨胀体积变小，因此与不进行预吸入的情况相比，变得不易发生挥发性液体自移液管的漏液，挥发性液体的测量精度提高。

对于本发明的液体处理装置，控制用于驱动移液管的驱动机构的控制部以在利用移液管吸入挥发性液体的过程中，在执行上述预吸入后进行挥发性液体的吸入的方式构成，因此挥发性液体自移液管的漏液变得不易发生，挥发性液体的测量精度提高。

附图说明

图1为示出液体处理装置的一实施例的概要构成图。

图2为示出该实施例的液体吸入时的一系列操作的一例的流程图。

图3示意性示出该实施例的液体吸入后的吸头内的状态。

图4为用于将进行了预吸入的情况与未进行预吸入的情况的吸头内的液体剩余量进行比较的图像图，(a)为进行了预吸入的情况，(b)为未进行预吸入的情况。

图5为示出针对进行了预吸入的情况与未进行预吸入的情况、通过连续稀释得到的肽标准曲线的曲线图。

图6为示出将空气层体积设为2μl而进行了预吸入的情况的吸头内的液体剩余量的图像图。

图7为示出将空气层体积设为3μl而进行了预吸入的情况的吸头内的液体剩余量的图像图。

图8为示出将空气层体积设为5μl而进行了预吸入的情况的吸头内的液体剩余量的图像图。

图9为示出将空气层体积设为10μl而进行了预吸入的情况的吸头内的液体剩余量的图像图。

图10为示出将空气层体积设为50μl而进行了预吸入的情况的吸头内的液体剩余量的图像图。

图11为示出将空气层体积设为100μl而进行了预吸入的情况的吸头内的液体剩余量的图像图。

图12为示出将空气层体积设为150μl而进行了预吸入的情况的吸头内的液体剩余量的图像图。

具体实施方式

以下，对于本发明的挥发性液体的处理方法以及执行该处理方法的液体处理装置的一实施例，使用附图进行说明。

首先，使用图1对液体处理装置的一实施例进行说明。

该实施例的液体处理装置中，多个移液管2以排成一列的状态被保持件10保持。移液管2具备：沿铅直方向配置的筒4、在筒4内沿上下方向滑动的活塞6、以及安装于筒4的下端的吸头8。吸头8在前端具有吸入/排出口，该吸入/排出口铅直向下。

各移液管2伴随活塞4向上方的操作而从吸头8的吸入/排出部吸入液体、气体，伴随活塞4向下方的操作而从吸头8的吸入/排出部排出液体、气体。另外，移液管2在水平面内方向和铅直方向上移动，对期望的容器进行液体的吸入和排出。该实施例中，全部移液管2被共通的保持件10保持，保持件10在水平面内方向和铅直方向上移动，从而各移液管2在水平面内方向和铅直方向上移动。

驱动机构12包括用于对活塞4进行操作的机构、用于使保持件10移动的机构。驱动机构12的操作利用控制部14来进行控制。控制部14利用通用的个人计算机或专用的计算机来实现。

在比移液管2靠下方的位置以与各移液管2对应的方式设置有容纳挥发性液体的多个挥发性液体容器16、以及容纳低挥发性液体的多个低挥发性液体容器18。

作为挥发性液体容器16中容纳的挥发性液体，可列举出乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、甲苯、异丙醇、己烷、丁醇、环己烷、乙二醇、苯、氯仿、乙醛、三乙胺、苯酚、萘、甲醛、四氢呋喃、乙酸乙酯等液体、以及以10％以上包含这种液体的液体。

作为低挥发性液体容器18中容纳的低挥发性液体，可列举出水、二甲基亚砜、甘油、苯酚、甲苯。容纳于低挥发性液体容器18中的低挥发性液体在利用移液管2来量取上述挥发性液体时使用。

控制部14构成为在吸入液体时控制驱动机构12来执行以下操作的方式。对于吸入液体的一系列操作，与图1一起使用图2的流程图来进行说明。

在开始液体的吸入操作时，首先，确认吸入对象的液体是否为挥发性液体。为了确认是否为挥发性液体，例如，在设置于控制部14的数据存储器等存储区域中存储有挥发性液体的列表，将吸入对象的液体与该列表对照，从而判定吸入对象的液体是否为挥发性液体。

若吸入对象的液体不是挥发性液体，则仅按规定量从各移液管2的前端的吸入/排出口吸入该液体。由此，在安装于各移液管2的前端的吸头8内，采集仅规定量的吸入对象的液体。各吸头8内采集的液体在后续被分注到规定的分注容器。

另一方面，吸入对象的液体为挥发性液体的情况下，首先执行低挥发性液体吸入操作。低挥发性液体吸入操作中，使移液管2移动至对应的低挥发性液体容器18的位置，将各吸头8的前端插入到低挥发性液体容器18内，从各低挥发性液体容器18吸入预设量的低挥发性液体。

上述低挥发性液体吸入操作完成后，执行空气吸入操作。空气吸入操作中，在将各移液管2的前端的吸头8从低挥发性液体容器18拉出的状态下对各移液管2进行吸入驱动，使各移液管2中吸入预设量的空气。由此，在移液管2内的低挥发性液体层的下方形成空气层。以下，将低挥发性液体吸入操作和空气吸入操作合称为“预吸入”。

在上述预吸入后，执行挥发性液体吸入操作。挥发性液体吸入操作中，使移液管2移动至容纳有吸入对象的挥发性液体的挥发性液体容器16的位置，从各挥发性液体容器16吸入规定量的挥发性液体。

如此，通过依次执行低挥发性液体吸入操作、空气吸入操作及挥发性液体吸入操作，即，通过在挥发性液体吸入操作前进行预吸入，从而如图3的(a)所示那样，在移液管2的吸头8内，自吸头8的基端侧起依次形成低挥发性液体的层、空气层、挥发性液体的层。

当在不进行上述预吸入的情况下从吸头8的前端吸入挥发性液体时，如图3的(b)所示，在挥发性液体与活塞6之间存在庞大体积的空气层。挥发性液体与活塞6之间的空气层的体积大时，因挥发性液体的挥发的影响而使该空气层显著膨胀，由此使挥发性液体被挤出而发生漏液。

该实施例中，通过在挥发性液体吸入操作前进行预吸入，可因挥发性液体的挥发而膨胀的空气层的体积小于不进行预吸入的情况，因此由挥发性液体的挥发的影响造成的空气层的膨胀体积也变小，变得不易从吸头8的前端发生漏液。

图4为进行了预吸入的情况(a)、未进行预吸入的情况(b)各自的、拍摄刚吸入70％acn溶液后(0秒)与自吸入70％acn溶液起经过60秒后的吸头而得到的图像图。

该验证中，作为液体处理装置使用自动分注装置bravo(agilent公司的产品)，作为吸头将2-250μl用的吸头安装于装置的移液管前端。(a)的“有预吸入”的情况下，首先，在吸入10μl作为低挥发性液体的水后吸入3μl的空气(预吸入)，然后吸入2μl70％acn溶液(70％acn/30％h2ov/v)。(b)的“无预吸入”的情况下，吸入2μl70％acn溶液(70％acn/30％h2ov/v)而不进行预吸入。

该验证的结果，“有预吸入”的情况和“无预吸入”的情况均在刚吸入70％acn溶液后(0秒)在吸头的前端存在有相同程度的70％acn溶液。但是，自吸入70％acn溶液起经过60秒后(60秒后)，“有预吸入”的情况下，吸头的前端的70％acn溶液几乎没有减少，也未观察到自吸头前端的漏液，另一方面，“无预吸入”的情况下，吸头的前端的70％acn溶液大幅减少，确认到自吸头前端的漏液。因此，由该验证结果确认了，通过进行预吸入，能够抑制自吸头前端的漏液。

图5为示出进行了预吸入的情况和未进行预吸入的情况的通过连续稀释得到的肽标准曲线的验证结果的曲线图。实线为进行了预吸入的情况，虚线为未进行预吸入的情况。

该验证中，将溶解于70％乙腈(acn)溶液的aβ1-38肽(2000amol/μl)用70％acn溶液连续稀释。理论上，aβ1-38肽的浓度成为1000amol/μl、500amol/μl、250amol/μl、125amol/μl、62.5amol/μl。70％acn溶液中，溶解有稳定同位素标记的aβ1-38肽(sil-aβ1-38)250amol/μl作为用于使由质谱仪(maldi-tofms)测量到的aβ1-38信号标准化(normalize)的内标。将通过各方法稀释的溶液逐个向μfocusmaldiplate^tm900μm中滴加1μl，使其干固。对各溶液分别滴加3孔(well)，然后用maldi-tofms测量。

质谱数据使用aximaperformance(shimadzu/kratos,manchester,uk)以正离子模式的lineartof来取得。lineartof的m/z值由峰的平均质量表示。关于m/z值，使用humanangiotensinii和humanacthfragment18-39、bovineinsulinoxidizedbeta-chain、bovineinsulin作为外标来进行校准。

将使所得aβ1-38的信号用sil-aβ1-38的信号进行标准化而得到的结果设为标准化强度(normalizedintensity)。使用aβ1-38浓度和标准化强度制作标准曲线，在进行了预吸入的情况与未进行预吸入的情况下进行比较。未进行预吸入的情况下，将浓度稀释2倍时的标准化强度降低了超过2分之1，未画出线性。另一方面，进行了预吸入的情况下，将浓度稀释2倍时标准化强度也减少至2分之1，画出了线性。线性回归方程中的决定系数(r²)在通常方法中r²＝0.9718，另一方面，在进行了预吸入的情况下r²＝0.9993，由此显示通过进行预吸入而能拟合成直线。该结果显示，在不进行预吸入的情况下，因漏液而只注入了比意图的量少的量的溶液，在进行了预吸入的情况下，该漏液受到抑制，准确地注入了与意图的量相同程度的溶液。

由以上的结果显示，通过进行预吸入，自移液管2的前端的漏液受到抑制，能提高挥发性液体的测量精度。

图6～图12为示出针对预吸入中的空气吸入量与漏液抑制效果的关系的验证结果的图像图。这些图像是从斜下方拍摄安装于筒的下端的吸头而得到的。该验证中，作为预吸入而在吸入10μl水后吸入2μl(图6)、3μl(图7)、5μl(图8)、10μl(图9)、50μl(图10)、100μl(图11)、150μl(图12)空气，然后吸入2μl70％acn溶液，观察其后经过60秒时的吸头内的状态。

该验证中，空气吸入量为10μl以下的情况下，吸入后经过60秒后也基本上没有看到吸头内的70％acn溶液减少，可知抑制了漏液。但是，空气吸入量为50μl、100μl的情况下，在吸入后60秒看到吸头内的70％acn溶液的减少，可知发生了漏液。

由该验证确认了，虽然通过进行预吸入而能够抑制挥发性液体的漏液，但是，若低挥发性液体与挥发性液体之间的空气层的体积变大，则由挥发性液体的挥发的影响造成的膨胀体积变大，漏液抑制效果降低。确认了在该验证中使用的条件下，若空气吸入量为10μl以下，则挥发性液体的减少量被抑制在吸入量的10％以内，能够得到充分的漏液抑制效果。需要说明的是，预吸入中的空气吸入量可以根据挥发性液体的挥发度、吸入量而调整为适当的量。

以上，以具备多个移液管2的液体处理装置为例进行了说明，但本发明的处理方法及液体处理装置不限定于此，也可以应用于仅使用1个移液管的处理方法及液体处理装置。

另外，本发明的处理方法不仅能在上述实施例那样的液体处理装置中实施，还能在手动操作移液管来进行液体处理的情况下实施。

附图标记说明

2移液管

4筒

6活塞

8吸头

10保持件

12驱动机构

14控制部

16挥发性液体容器

18低挥发性液体容器