一种龙虎人丹植物药中的14种不挥发性成分的含量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药成分的含量测定方法及其质量控制方法，具体涉及龙虎人丹植物 药的含量检测法及其质量控制方法。
【背景技术】
[0002] 龙虎人丹（国药准字Z20025168)创制于1909年，由黄楚九先生根据古方"诸葛行 军散"化裁而来，主要由薄荷脑、丁香、肉桂、儿茶、甘草等十一味中药构成，其功能主治为清 暑开窍，辟秽排浊，驱风健胃。1923年"龙虎牌"和"人丹及图案"商标向政府申请并获核 准，成为国内第一个规范的医药注册商标，是上海乃至中国的民族制药工业发端的标志。百 年来龙虎人丹产品销售经久不衰，成为销售过亿的独家传统中药品种。
[0003] 由于龙虎人丹由中药制成，受到药物产地、采收季节及制备工艺等多种因素的影 响，制成的制剂在确保疗效一致性上具有较大难度。因此，有必要对龙虎人丹植物药的成分 的组成和含量进行严格的质量控制。目前，关于龙虎人丹的质量控制方法主要有显微鉴别、 薄层鉴别、高效液相色谱法和气相色谱法，张玉杰等利用气相色谱法测定其中冰片、薄荷脑 的含量，上述方法只针对龙虎人丹中的单个成分，检测时间较长，样品检测前处理步骤复杂 等。到目前为止，未见有关龙虎人丹中同时检测多种成分的研究报道，无该复方中（1)儿茶 素、（2)表儿茶素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)异甘草苷、（6)甘草素、（7)刺甘草查尔 酮、（8)甘草酸、（9)异甘草素、（10)胡椒碱、（11)甘草查尔酮A、（12)木香烃内酯、（13)去 氢木香内酯、（14)甘草次酸的同时测定方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的主要目的是利用液相色谱-LCQ离子阱质谱联用技术，对龙虎人丹植物 药中14种不挥发性成分进行定性定量分析，确保产品质量稳定。
[0005]本发明所采用的技术方案：
[0006] -种龙虎人丹植物药中14种不挥发性成分含量的检测方法，该方法由以下步骤 组成：
[0007] (1)配制供试品溶液：取龙虎人丹植物药用溶剂配制成0.3~2mg /ml的供试品 溶液；
[0008] 配制对照品溶液：精密称取对照品适量，置于10mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释 至刻度。摇匀，得各对照品储备液，置于4°C冰箱保存。
[0009]精密量取各储备液适量，用乙腈-水（30 : 70,v / v)稀释,得各对照品的混合标 准溶液。
[0010] 按进样量为1~20 i! L对Thermo BDS Hypersil C18色谱柱进样，控制柱温为 20°C~40°C，接着用由A相和B相组成的流动相以0. 2~1. 5mL / min的速度按照表1的 程序进行梯度洗脱，同时利用液相色谱-LCQ离子阱质谱联用技术检测洗脱液，获得供试品 药物及对照品药物的离子色谱图；
[0011]表 1
[0013] (2)所得对照品溶液的离子色谱图从左至右分别为儿茶素、表儿茶素、夏佛托苷、 甘草苷、异甘草苷、甘草素、刺甘草查尔酮、甘草酸、异甘草素、胡椒碱、甘草查尔酮A、木香烃 内酯、去氢木香内酯、甘草次酸，供试品的离子色谱图与对照品溶液的图谱此较，相应成分 的保留时间相同的峰即是与该成分相同物质的特征峰，每个成分按表4内的标准曲线计算 含量；
[0014]表 4
[0016] (1)儿荼素、（2)表儿荼素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)异甘草苷、（6)甘草素、 (7)刺甘草查尔酮、（8)甘草酸、（9)异甘草素、（10)胡椒碱、（11)甘草查尔酮A、（12)木香 烃内酯、（13)去氢木香内酯、（14)甘草次酸
[0017] 上述步骤中，
[0018] 配制供试品溶液或对照品溶液所用的溶剂为20~40%的乙腈，或者是与之流动 性相似的溶剂；
[0019] 所述流动相A相为纯水含0? 005~0? 015%甲酸（含0? 2mM甲酸铵）；
[0020] B相为乙腈；
[0021] 实验中质谱条件为：LCQ离子阱质谱，离子源为ESI，离子喷雾电压5000V(+)、 4500V (-)，鞘气压30psi，辅助气压5psi，毛细管电压26V (+)、-37V (-)，毛细管温度300°C。 扫描方式为全扫描模式。
[0022] 本发明中供试品溶液的制作方法为：龙虎人丹粉碎成细粉，称取龙虎人丹粉末 30mg，加30 %乙腈lOmL，超声处理20min，称定重量，补足所失重量，12000rpm离心10min后 取上清，进样。
[0023] 本发明中供试品溶液的制作方法还可以采用加热回流法，即龙虎人丹粉碎成细 粉，称取龙虎人丹粉末30mg，加10mL20-40 %乙腈，加热回流20-30min，10000-15000rpm离 心lOmin后取上清，进样。
[0024] 本发明中优选的梯度洗脱程序如表2。
[0025]表 2
[0027] 本发明中最优选的梯度洗脱程序如表3。
[0028]表 3
[0030] 本发明中在供试品配制过程中的稀释溶剂为30%的乙腈。
[0031] 本发明中在供试品溶液的制作过程中所使用的乙腈溶剂浓度可以放宽范围至 20-40%。
[0032] 本发明中可以使用丙酮、甲醛或乙二醇代替供试品溶液的制作过程中所使用的乙 腈溶剂。
[0033] 本发明中可以使用丙酮、甲醛或乙二醇代替供试品溶液的加热回流法制作过程中 所使用的乙腈溶剂。
[0034] 本发明中对照品溶液配制过程中稀释剂乙腈-水的此例可选择为20-40%。
[0035] 本发明中在配制对照品溶液过程中可以使用丙酮或甲醇替代稀释溶剂乙腈。
[0036] 本发明中在配制供试品溶液中的流动相A为纯水含0. 01%甲酸（含0. 2mM甲酸 铵）。
[0037] 本发明方法测试中发现14种成分的标准曲线、定量限和检测限、各成分的检测离 子见表4,结果表明在一定浓度范围内十四种成分的线性关系良好。
[0038]表 4
[0039]
[0040] (2)儿茶素、（2)表儿茶素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)异甘草苷、（6)甘草素、 (7)刺甘草查尔酮、（8)甘草酸、（9)异甘草素、（10)胡椒碱、（11)甘草查尔酮A、（12)木香 烃内酯、（13)去氢木香内酯、（14)甘草次酸
[0041] 本发明方法中的精密度试验结果为14种成分的RSD〈4. 46%，表明精密度良好。准 确度考察结果见表5,14种成分的回收率在94. 41-103. 39%之间，RSD〈6. 05%，表明准确度 良好。
[0042]表 5
[0044] (1)儿茶素、（2)表儿茶素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)异甘草苷、（6)甘草素、 (7)刺甘草查尔酮、（8)甘草酸、（9)异甘草素、（10)胡椒碱、（11)甘草查尔酮A、（12)木香 烃内酯、（13)去氢木香内酯、（14)甘草次酸
[0045] 本发明方法中的重现性结果见表5, RSD在0. 66-4. 99%之间，结果表明样品重现 性良好。
[0046] 稳定性考察显示，4°C条件下，龙虎人丹样品溶液至少24h内稳定（RSD〈4. 69%)。
【附图说明】
[0047] 图1为总离子色谱图，其中A:在负离子模式下的混合对照品图；B:正离子模式下 的混合对照品图；C:负离子模式下的样品图；D:正离子模式下的样品图；（1)儿茶素、（2) 表儿茶素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)异甘草苷、（6)甘草素、（7)刺甘草查尔酮、（8)甘 草酸、（9)异甘草素、（10)胡椒碱、（11)甘草查尔酮A、（12)木香烃内酯、（13)去氢木香内 酯、（14)甘草次酸。
[0048] 图2为对照品A和样品B中的提取离子色谱图：⑴儿茶素、⑵表儿茶素、⑶夏 佛托苷、（4)甘草苷、（5)异甘草苷、（6)甘草素、（7)刺甘草查尔酮、（8)甘草酸、（9)异甘草 素、（10)胡椒碱、（11)甘草查尔酮A、（12)木香烃内酯、（13)去氢木香内酯、（14)甘草次酸
【具体实施方式】
[0049] 以下结合实施例对本方面做进一步的描述。
[0050] 实施例一