本发明具体涉及一种基于层层自组装法制备活性基底及检测结晶紫的方法，属于纳米技术和分析化学检测领域。
背景技术：
拉曼光谱技术具有快速，无损，特异性强，受水或醇溶液干扰小等特点，但是由于拉曼散射大约只占分子散射的千万分之一，所以灵敏度不足这一弱点限制了它在痕量物质检测方面的应用（参见文献：j.j.laserna,moderntechniquesinramanspectroscopy,newyork，chichester,1996；任斌，田中群，表面增强拉曼光谱的研究进展，现代仪器，2004，10(5)，1-13）。随着金属纳米材料制备的进一步发展，表面增强拉曼光谱检测技术应运而生，且在金属纳米颗粒溶胶体系的应用下使得这一技术的灵敏度进一步提高，普通拉曼信号可增强至1014至1015倍，达到单分子检测水平（参见文献：s.nie,r.e.steven,science,1997,275(5303),1102）。
表面增强拉曼光谱检测技术的关键在于是否有高效的活性基底。到目前为止，应用最为广泛的基底是溶胶状基底和固体基底。传统的溶胶状基底主要包括纳米颗粒直径在10nm到200nm之间的金（au）或银（ag）溶胶，合成它们最经典的方法分别是frens方法和lee方法（参见文献：g.frens.naturephysicalscience,1973,241(1):20;p.c.leeandd.melsel.journalofphysicalchemistry,1982,86(17):3391），分别以氯金酸和硝酸银为前驱体，柠檬酸钠为还原剂，通过化学还原法制备。由于纳米粒子（nps）之间的聚集难以控制，点与点之间信号强度均不同，因而重复性较差。更加严重的是粒子的聚集易形成沉淀，继而从溶液中析出导致sers信号大幅减弱。传统的固相sers基底主要有电化学粗糙的电极、金属岛膜、表面纳米微结构等。制备方法主要分为粗糙化的固体界面和组装粒子膜两种。由于这些传统的固相sers基底要么制备过程复杂，成本高昂，要么由于基底结构之间的差异，分析物在两种基底上有不同的检测结果，这使得自制固态基底成为研究的热点。
这几年，自组装技术合成纳米颗粒固相基底逐渐成熟。此技术的核心在于固体基片（玻璃、硅片或金属）表面修饰一层两亲分子，两亲分子的一头与固体基片连接，另一头通过化学或静电的作用与纳米颗粒相连，进而使纳米颗粒在固体基片表面有序排列，形成一层有序薄膜。2009年李长明等（参见文献：weiyongyuan,changmingli.langmuir,2009,25(13),7578）利用弱电解质聚乙烯亚胺和柠檬酸根稳定的纳米金溶胶制备了层层自组装的弱电解质/金属纳米粒子复合膜，并通过调节ph大小改变粒子间空间距离，进而考察了其对局域表面等离子共振吸收的影响。同年，saraabalde-cela等人（参见文献：saraabalde-cela,szushenho,benitorodrguez-gonzlez.angew.chem.int.ed.2009,48,5326）利用弱电解质聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚丙烯酸和ag纳米溶胶制备了层层自组装薄膜，并且证明此膜具有较好的光学增强特性，用此基底检测环境污染物二噁英，证明此基底有一定的表面增强拉曼性能。zhichengliu等人（参见文献：zhichengliu,zhaodongyan,lubai.appliedsurfacescience,2016,360,437）在2016年进一步通过层层自组装技术制备纳米薄膜，并探究了其作为高稳定性、可重现性表面增强活性基底在sers领域的应用前景。
因此，本发明在前人的基础上，进一步完善固相基底制备过程，以ito玻璃片为基片，利用层层自组装法制备aunps固相基底，并以结晶紫（cv）为检测对象，考察基底的表面增强拉曼性能，进而对cv进行定量检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于拓展现有用于表面增强拉曼光谱检测的sers活性基底，提供了一种基于层层自组装法制备活性基底及检测结晶紫的方法。本发明提供的制备方法简单易行，成本较低，此活性基底用于结晶紫拉曼光谱检测具有重现性好，基底均一稳定，检测性能优良等优点，有望进一步推广到环境检测等领域。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种基于层层自组装法制备活性基底的方法，包括以下步骤：
1）首先，ito玻璃作为基片，经洗涤溶剂洗涤干净，置于由水、双氧水以及氨水组成的混合溶液中进行氧化处理后，浸泡在聚二烯基丙二甲基氯化铵（pdda）水溶液中，静置30min左右，制得表面组装有阳离子聚电解质双分子层的底片；
2）然后，再将该底片放于纳米金溶胶中，静置12h，取出，用去离子水冲洗，氮气吹干，得单层自组装的pdda/aunps表面增强拉曼活性基底；
3）之后反复重复上述两步，得多层自组装的pdda/aunps活性基底；最终选择组装三层的pdda/aunps基底作为检测基底。
步骤1）中所述混合溶液中，水、双氧水以及氨水的体积比为5:1:1。
步骤1）中ito玻璃片的氧化处理的条件为：将ito玻璃片放于混合溶液中，在80℃的水浴下反应60min。
步骤1）中所使用的聚二烯基丙二甲基氯化铵（pdda）水溶液浓度为1.0mg/ml，溶液内含有氯化钠的浓度为1.5mol/l，pdda的分子量为mw=200000~350000。
步骤2）中所用的纳米金溶胶制备方法为：在100ml超纯水中加入1.0ml1wt%的氯金酸溶液，加热搅拌，温度一直上升到120℃时开始计时，计时30min，此时分别迅速加入1.0~3.0ml1wt%的柠檬酸钠溶液，加热20min后，停止加热，磁力搅拌冷却至室温，得不同粒径的纳米金溶胶。
最终选择加入1.5ml1%的柠檬酸钠溶液制得的纳米金溶胶，此aunps的粒径大约30nm左右。
最终选择组装三层的pdda/aunps基底作为检测基底。
活性基底的吸收光谱利用tu-1950紫外可见分光光度计进行表征。
活性基底形貌以及粒径大小利用扫描电子电镜进行表征。
以cv为检测对象，对该固相活性基底的优良性进行考察。
（1）精确称取0.00204g结晶紫固体（分子量=407.98分析标准品aladdin），乙腈作溶剂溶解定容，配成浓度为0.1mm的结晶紫储备溶液；依次用溶剂稀释成待检测浓度的结晶紫溶液；
（2）将制备好的该基底放于不同浓度梯度的cv标准溶液中，浸泡2h，然后取出自然晾干；
（3）将其进行表面增强拉曼光谱（sers）检测；sers检测过程中采用的仪器为invia型显微共聚焦拉曼光谱仪（雷尼绍，英国），选择的激光光源为633nm光源，激光功率为5%，10s曝光时间，扫描范围为400～1800cm-1，每个样品重复检测3次，每次检测每个样品平均扫描6次，所得数据由labspec5数据处理软件处理后应用；
（4）对活性基底的光学面（ito面和普通玻璃面）进行检测比较，结果表明ito面的sers增强效果高于普通玻璃面；
（5）以1615cm-1处峰强为代表计算其相对标准偏差（rsd），均一性考察的rsd为5.9%，批间重现性的rsd为3.3%，批内稳定性的rsd为6.7%；表明该活性基底均一性良好，且具有较好的重现性；
（6）以该活性基底通过表面增强拉曼光谱检测技术对cv溶液进行定量检测。以cv标准溶液浓度ccv为横坐标，其对应的cv拉曼特征峰1615cm-1，1174cm-1处的拉曼光谱信号强度i为纵坐标，建立两者之间的线性关系，得到cv浓度与拉曼光谱强度i的线性方程。结晶紫浓度（0.0005-0.1mm）范围与其对应的1615cm-1和1174cm-1处的拉曼光谱信号强度i之间都存在较好的线性关系，线性方程：i1615cm-1=738558.2ccv/mm+5819，线性相关系数为r2=0.9953；i1174cm-1=342814ccv/mm+2699.7，线性相关系数为r2=0.9951。
本发明的优点在于：
本发明提供的制备方法成本低廉，易于操作，此活性基底用于结晶紫拉曼光谱检测具有重现性好，基底均一稳定，检测性能优良等优点，有望进一步推广应用。
附图说明
图1中（a）为加入1.5ml1wt%的柠檬酸钠溶液制得的3号纳米金溶胶紫外可见光谱图；图1中（b）为层层自组装法制备pdda/aunps活性基底的紫外可见光谱图（a-g分别为经组装aunps1、2、3、4、5、6、7层）；
图2为活性基底的场发射扫描电镜图（a-d分别为经组装aunps1、2、3、4层）；
图3为活性基底的ito面和普通玻璃面比较（a为组装有不同粒径的aunps相同层数的活性基底的ito面和普通玻璃面比较；b为组装有相同粒径的aunps不同层数的活性基底的ito面和普通玻璃面比较）；
图4为该活性基底的优良性考察图（a为基底的均一性考察图；b为基底的稳定性考察图；c为基底的重现性考察图）；
图5为本发明对结晶紫标准溶液的检测结果：(a)为不同浓度cv表面增强拉曼光谱；(b)为cv浓度ccv与1615cm-1和1174cm-1处信号强度i之间的标准曲线。
具体实施方式
为了进一步表明本发明所制备的活性基底的sers增强效果和对cv检测的作用，结合下列实施实例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1
三层pdda/aunps基底的制备：
1）基片的处理：首先将ito玻璃片依次放于自来水、乙醇、丙酮、异丙醇和超纯水中超声清洗20min；然后再置于由水、双氧水和氨水（v/v/v=5:1:1）组成的混合溶液中，80℃下沸腾处理60min，取出ito玻璃片，用超纯水反复清洗沸腾处理的ito玻璃片，保存于超纯水中备用；
2）活性基底的制备：
（1）aunps的制备：采用经典的柠檬酸钠还原法。即，100ml超纯水中加入1.0ml1wt%的氯金酸溶液，加热搅拌，温度一直上升到120℃时开始计时，计时30min，此时分别迅速加入1.0～3.0ml1wt%的柠檬酸钠溶液，加热20min后停止加热，磁力搅拌冷却至室温，得1，2，3，4号四种不同粒径的纳米金溶胶，最终选择加入1.5ml1wt%的柠檬酸钠溶液制得的3号纳米金溶胶，此aunps的粒径大约30nm左右；
（2）aunps的组装：将先前活化好的ito玻璃片放于1mg/ml的pdda水溶液中浸泡30min，取出，用去离子水将浮液洗去，然后放于纳米金溶胶中浸泡12h，为一层pdda/aunps组装完成；之后再次在相同条件下在pdda水溶液和纳米金溶胶中浸泡，得二层(pdda/aunps)2，继续此过程得(pdda/aunps)n，最终选择组装三层pdda/aunps基底作为最终检测基底；
对实施例1制得的aunps以及活性基底进行光学性质和形貌表征。分别采用紫外可见分光光度计与场发射扫描电子显微镜对其进行研究。我们选择3号纳米金作为活性基底制备组装的最佳纳米粒子。通过图1层层自组装法制备pdda/aunps活性基底的紫外可见光谱，图1中(a)纳米金溶胶液体的紫外可见光谱检测可知，3号金的等离子体共振吸收（spr）在528nm左右。图1的(b)中，从a曲线能够看到一个小的spr峰在534nm左右，这和aunps粒子本身的吸收峰528nm相近，说明单分散的aunps成功的沉积在ito片表面，并且电介质环境只发生了轻微的变化。随着纳米金组装层数的增多，基线随之增长，且在700-900nm周围出现的越来越强烈越来越宽的区带，这来自于相邻aunps之间的粒间相互作用。由于固定的nps的密度越来越大，纳米金高度聚集和lspr耦合，此区域的峰随着自组装层数的增加而发生红移，这清晰地证明了aunps多层组装的形成。图2为活性基底的场发射扫描电子显微镜图，从图2中(a)可见ito表面上均匀地分布有一层aunps(粒径约30nm左右），且粒子之间有较好的分散性。随着沉积次数的增多，越来越多的aunps被吸附在表面，表面覆盖范围显著增加。
实施例2
以结晶紫（cv）为检测对象，对该固相活性基底的优良性进行检测。
（1）精确称取0.00204g结晶紫固体（分子量=407.98分析标准品aladdin），乙腈作溶剂溶解定容，配成浓度为0.1mm的结晶紫储备溶液，依次用溶剂稀释成待检测浓度的结晶紫溶液；
（2）将制备好的该基底放于不同浓度梯度的cv标准溶液中，浸泡2h，然后取出自然晾干；
（3）将其进行表面增强拉曼光谱（sers）检测；sers检测过程中采用的仪器为invia型显微共聚焦拉曼光谱仪（雷尼绍，英国），选择的激光光源为633nm光源，激光功率为5%，10s曝光时间，扫描范围为400～1800cm-1，每个样品重复检测3次，每次检测每个样品平均扫描6次，所得数据由labspec5数据处理软件处理后应用；
（4）对活性基底的光学面（ito面和普通玻璃面）进行检测比较，结果表明ito面的sers增强效果高于普通玻璃面（见图3）；
（5）从均一性，稳定性以及重现性三方面出发对该固相活性基底的优良性进行考察（见图4）。将组装有3层3号纳米金的固相基底放于0.01mm的cv乙腈溶液中浸泡2h，取出氮气吹干后在固相基底表面随机选取10个点进行表面增强拉曼光谱检测，以光谱中1615cm-1，1174cm-1两个谱峰为代表计算其相对标准偏差，1615cm-1与1174cm-1拉曼谱峰强度的rsd分别为5.9%和6.0%。由此可见，实验制备的固相基底表面具有良好的均匀性；在相同实验条件下，将3组不同批次制备的sers基底放于0.01mm的cv乙腈溶液中浸泡2h，取出氮气吹干，用以检测不同批次制备的基底对cv溶液检测的一致性。将同一批次制备的sers基底储存不同时间。然后分别放于0.01mm的cv乙腈溶液中浸泡2h，取出氮气吹干，用以检测同一批次制备的基底储存不同时间对cv溶液检测的偏差。同样以光谱中1615cm-1，1174cm-1两个谱峰为代表计算其批间重现性rsd，1615cm-1与1174cm-1拉曼谱峰强度的rsd分别为3.3%和4.0%；批内稳定性rsd，1615cm-1与1174cm-1拉曼谱峰强度的rsd分别为6.7%和5.3%。由此表明，实验制备的固相基底具有良好的重现性与稳定性；
（6）以该活性基底通过表面增强拉曼光谱检测技术对cv溶液进行定量检测。以cv标准溶液浓度ccv为横坐标，其对应的cv拉曼特征峰1615cm-1，1174cm-1处的拉曼光谱信号强度i为纵坐标，建立两者之间的线性关系；如图5所示，随着结晶紫溶液浓度的增大，结晶紫的拉曼特征谱峰强度随之显著增大，且特征峰强度与结晶紫溶液的浓度存在一定的相关性。结晶紫溶液浓度（0.1mm-0.0005mm）与1615cm-1和1174cm-1处的拉曼光谱信号强度之间有良好的线性关系，线性方程：i1615cm-1=738558.2ccv/mm+5819（r2=0.9953）；i1174cm-1=342814ccv/mm+2699.7（r2=0.9951）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。