本发明涉及电化学分析领域，具体涉及一种电化学发光分析仪所用底物及其制备方法和应用。
背景技术：
电化学发光免疫分析技术是瑞士罗氏公司发明的免疫分析技术中的一种。其广泛应用于甲状腺、性激素、骨代谢、心肌梗塞、肿瘤标志物、传染病抗原抗体等的定量测定。其基于的反应原理是抗原抗体的免疫反应。
反应过程如下：①仪器吸取含有抗体、抗原或是酶的生物素试剂以及包被有链霉亲和素的磁性微球复合物，加入到反应杯混合，在37℃温育盘中反应9～27min，使待测物质与生物素化后的抗体、抗原或酶特异性结合；②结合完成后用预清洗液(简称precleanm)去除潜在的干扰物质，使未结合的成分在复合物被送入测量池之前均被移去；③探针再吸取含有三丙胺的发光缓冲液到测量池中，其中发光缓冲液中三丙胺的浓度为180mmol/l；④最后用测量池清洗液(cleancell)清洗整个管路。
反应机理为：反应液中待测物在电场的作用下，其发光标记物失去一个电子氧化成三价的三联吡啶钌，同时三丙胺也失去一个电子被氧化，脱氢成三丙胺自由基，三丙胺自由基传递一个电子给三价三联吡啶钌使之变成激发态；而处于激发态的二联吡啶钌不稳定，以发射一个波长为620nm光子的形成释放能量而回到基态，三联吡啶钌不被消耗，再接受三丙胺的传递的电子循环发光。安装在测量池上部的光电倍增管接收620nm光子的光信号，并将其转换成电信号，电信号的幅值与待测物浓度或含量成比例关系，最后通过计算得出所测定物质的浓度或含量。
在电化学发光整个过程中，需要使用发光缓冲液、检测池清洗液、预清洗液才能完成测量，而罗氏原装底物成本高。因此使之国产化、并达到结果准确可靠、降低检测成本具有重要的社会效益和经济效益。
经检索得知，2015年2月18日公开号为cn104360051a、2015年6月10日公开号为cn104698164a、2016年11月16日公开号为cn106124753a的专利申请进行了相关研究，但其技术上均存在问题和风险。因为在电化学发光过程中，三丙胺被氧化成二丙胺和丙醛，自身被不断地消耗，待测物质的浓度越高，需要消耗的三丙胺的量就越多。罗氏公司的原装发光缓冲液(procell)含有浓度180mmol/l的三丙胺，就是考虑到临床检验的人体样本中经常会出现高浓度的待测物质，在电化学检测中需要高达180mmol/l的三丙胺才能满足临床需要，如果发光缓冲液中的三丙胺浓度达不到如此浓度，直接导致测量范围降低，出现免疫反应的钩状效应，高浓度的病人样本结果就会不准确，致使结果偏低，甚至出现假阴性结果，造成临床漏诊风险，延误病人的诊断和治疗。
其中，公开号为cn104360051a的配方中含体积浓度为2.6％的三丙胺，其质量浓度为19.63g/l，浓度为罗氏原装浓度的76％，公开号为cn104698164a的配方中三丙胺12.0-16.0g/l，浓度为原装浓度的46～62％，公开号为cn106124753a的配方中三丙胺浓度为60～90mmol/l，浓度为原装浓度的33％～50％。在这些配方中，三丙胺的浓度都未达到罗氏原装的180mmol/l，导致高浓度的临床样本检测结果不准确，带来了潜在的漏诊风险。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的发光缓冲液公开配方中三丙胺浓度低于原装浓度，导致测量范围降低、高浓度临床样本检测结果不准确的问题，本发明的目的在于提供一种电化学发光分析仪所用底物及其制备方法和应用，本发明底物测量范围与原装产品相同，结果准确可靠，配制简单，成本低廉，稳定性长。
一种电化学发光分析仪所用底物，包括发光缓冲液、测量池清洗液和预清洗液，发光缓冲液包括聚合度为(12-16)的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为(6-10)的月桂醇聚氧乙烯醚。
具体地，发光缓冲液包括聚合度为(12-16)的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为(6-10)的月桂醇聚氧乙烯醚、85wt％的浓磷酸、2当量浓度的稀盐酸、二氯乙酰胺、磷酸二氢钾和三丙胺。
发光缓冲液更优选含有：
85wt％的磷酸(2-5)g/l，
2当量浓度的盐酸(0.1-1.0)g/l，
二氯乙酰胺1-3g/l，
聚合度为(12-16)的异辛醇聚氧基乙烯醚(0.6-1.2)g/l，
聚合度为(6-10)的月桂醇聚氧乙烯醚(0.8-1.5)g/l，
磷酸二氢钾(35-40)g/l，和
三丙胺(20-30)g/l。
具体地，测量池清洗液包括聚合度为(12-16)的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为(6-10)的月桂醇聚氧乙烯醚和85wt％氢氧化钾水溶液。
测量池清洗液更优选含有：
聚合度为(12-16)的异辛醇聚氧基乙烯醚(0.8-1.2)g/l，
聚合度为(6-10)的月桂醇聚氧乙烯醚(8-12)g/l，和
85wt％的氢氧化钾水溶液(8-12)g/l。
具体地，预清洗液为磷酸盐缓冲体系，含有85wt％的磷酸、二氯乙酰胺、聚合度为(12-16)的异辛醇聚氧基乙烯醚和聚合度为(6-10)的月桂醇聚氧乙烯醚。
预清洗液更优选含有
二水磷酸二氢钠(0.5-1.0)g/l，
十二水磷酸氢二钠(2.0-2.5)g/l，
氯化钠(1.0-1.5)g/l，
二氯乙酰胺(1.0-2.0)g/l，
85wt％磷酸(180-220)mg/l，
聚合度为(12-16)的异辛醇聚氧基乙烯醚(0.8-1.2)g/l，和
聚合度为(6-10)的月桂醇聚氧乙烯醚(0.8-1.2)g/l。
本发明还提供一种上述电化学发光分析仪所用底物的制备方法，包括如下步骤：①配制发光缓冲液：按照配方称量除三丙胺外各所需组分，与700毫升水混合，搅拌溶解；加入三丙胺，搅拌10分钟，定容至1000毫升，混匀；②配制测量池清洗液：按照配方称量各所需组分，与700毫升水混合，搅拌溶解，定容至1000毫升，混匀；③配制预清洗液：按照配方称量各所需组分，与700毫升水混合，搅拌溶解，定容至1000毫升，混匀。
优选的，异辛醇聚氧基乙烯醚聚合度为14，月桂醇聚氧乙烯醚聚合度为9。
一种低聚合度表面活性剂在制备电化学发光分析仪所用底物中的应用，该低聚合度表面活性剂包括聚合度为(12-16)的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为(6-10)的月桂醇聚氧乙烯醚。
优选的，异辛醇聚氧基乙烯醚聚合度为14，月桂醇聚氧乙烯醚聚合度为9。
本发明采用小分子量的低聚合度表面活性剂，优选选用呈液态的低聚态月桂醇聚氧乙烯醚和异辛醇聚氧基乙烯醚，改善胶束状态，控制乳化效率，并避免凝胶化。尤其增加发光缓冲液配制过程中的三丙胺溶解速率，使三丙胺的动态浓度不低于罗氏原装发光缓冲液，并与磷酸和盐酸相配合，增加电化学发光的灵敏度，联合保证测量范围，同时使用二氯乙酰胺作为防腐剂，保证发光缓冲液的稳定性，有效期能够达到24个月。
本发明测量池清洗液所含两种表面活性剂呈液体状态，易溶解，具有优良的乳化和湿润能力，降低表面张力效果明显，能完全去除反应体系中的污染物，保证测量管道的清洗效果。同时在配制过程中不需要加热和冷却，且不需要加入防腐剂，使配制过程简单，易于生产。
本发明预清洗液不仅使缓冲体系的酸碱度维持在中性，并且能够彻底清除潜在的干扰物质，使未结合的成分在免疫复合物被送入测量池之前均被移去，保证结果的特异性和准确性。
本发明所带来的综合效果包括：
本发明配方优良的发光缓冲液、测量池清洗液和预清洗液组成的成套底物，能够保证临床样本测量范围与原装一致，提高三丙胺溶解速率，检测准确性高，配方及制备方法简单易行，性能稳定，可达24个月有效，节省检验费用60％，具有显著的临床意义和经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例底物验证试验的ths测量范围验证回归图。
图2为本发明实施例底物验证试验的e2测量范围验证回归图。
图3为本发明实施例底物验证试验的prog测量范围验证回归图。
图4为本发明实施例底物验证试验的afp测量范围验证回归图。
图5为本发明实施例底物验证试验的ths测量范围验证回归图。
图6为本发明实施例底物验证试验的ths准确性验证回归图。
图7为本发明实施例底物验证试验的e2准确性验证回归图。
图8为本发明实施例底物验证试验的prog准确性验证回归图。
图9为本发明实施例底物验证试验的afp准确性验证回归图。
图10为本发明实施例底物验证试验的ths准确性验证回归图。
具体实施方式
本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。其它的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。
实施例
一种电化学发光分析仪所用底物及其制备方法，该包括发光缓冲液、测量池清洗液和预清洗液。
①发光缓冲液(简称procell)组成及制备方法为：
组成：85wt％的磷酸3.2g/l，
2当量浓度的盐酸0.5g/l，
二氯乙酰胺1.5g/l，
聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚1.0g/l，
聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚1.2g/l，
磷酸二氢钾39g/l，和
三丙胺26g/l。
制备：把烧杯放在天平上，置零，然后按照上述配方组成称量除三丙胺外所需要的组分，加入到烧杯中，加入700毫升水，搅拌5分钟溶解，加入三丙胺，搅拌10分钟，定容至1000毫升，混匀后既成。
②测量池清洗液(简称cleancell)组成及制备方法为：
组成：聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚1.0g/l，
聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚10g/l，和
85wt％的氢氧化钾水溶液10.5g/l。
制备：把烧杯放在天平上，置零，然后按照配方称量所需要的组分加入到烧杯中，
加入700毫升水，搅拌5分钟溶解，定容至1000毫升，混匀后既成。
③预清洗液(简称precleanm)为磷酸盐缓冲体系，其组成及制备方法为：
组成：二水磷酸二氢钠0.7g/l，
十二水磷酸氢二钠2.2g/l，
氯化钠1.35g/l，
二氯乙酰胺1.5g/l，
85wt％磷酸200mg/l，
聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚1.0g/l，和
聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚1.0g/l。
制备：把烧杯放在天平上，置零，然后按照配方称量所需要的组分加入到烧杯中，加入700毫升水，搅拌5分钟溶解，定容至1000毫升，混匀后既成。
④将配制的上述底物，包括发光缓冲液、测量池清洗液和预清洗液放置于罗氏电化学e601分析仪上用于电化学发光检测分析。
⑤放置分析试剂及质控品和临床样品，启动电化学发光601分析仪，无须重新校准，直接进行检测。
⑥检测完成后记录结果。
验证试验
将上述实施例底物用于电化学发光分析分别验证其精密度、测量范围、准确性和稳定性。
验证项目：本发明验证精密度挑选具有明显临床意义代表性的项目。
甲状腺激素，简称tsh，是一种分子量为30kd的蛋白质，tsh在垂体前叶的特异性嗜碱细胞内生成。tsh检测是查明甲状腺功能的初筛试验。游离甲状腺浓度的微小变化就会带来tsh浓度向反方向的显著调整，tsh是测试甲状腺功能的非常敏感的特异性参数，特别适合于早期检测或排除下丘脑-垂体-甲状腺中枢调节环路的功能紊乱。
雌二醇，简称e2，为最强的雌激素，主要由卵巢产生。检测雌二醇可用于解释下丘脑-脑垂体-性腺调节功能紊乱、男子女性型乳房、产生雌激素型的卵巢和睾丸肿瘤和肾上腺皮质增生等。
孕酮，简称prog，属于类固醇激素，分子量314.5d，主要在黄体的细胞以及妊娠期的胎盘中形成，孕酮的浓度与黄体的生长与退化密切相关。孕酮可以使子宫粘膜转变成腺体丰富的组织(分泌期)。孕酮测定用于生殖诊断：排卵期的检出和黄体期的估计。
甲胎蛋白，简称afp，来源于卵黄囊、未分化肝细胞和胎儿胃肠道。70－95％的原发性肝癌患者的afp升高，越是晚期，afp含量越高。
前列腺特异性抗原，简称tpsa，属糖蛋白,升高一般提示前列腺存在病变，如前列腺炎、良性增生或癌症。
一、精密度验证：
1验证意义：良好的精密度是测量范围和准确度的前提保证，因此首先需要验证其精密度。
2验证方法：本实施例根据美国的国家临床实验室标准委员会(简称nccls)ep5-a--临床化学设备操作精密度评价进行精密度验证。
2.1质控品来源：正常值质控品和异常值质控品均采用美国伯乐公司(bio-rad)生产的电化学发光e601分析仪配套的质控血清。
2.2批内精密度实验：选取正常值质控品和异常值质控品连续做20次，计算均值、标准差、变异系数(cv％)。以卫生部临床检验中心室间质量评价标准允许总误差的1/4为符合要求。
2.3批间精密度实验：每天正常值质控品和异常值质控品各检测4次，累计检测5天，各得20个检测结果。计算均值、标准差、变异系数(cv％)。以卫生部临床检验中心室间质量评价标准允许总误差的1/3为符合要求。
2.4统计结果见表1，从表1中可以看出，上述5个具有代表性的项目的精密度验证结果均符合要求。
表1电化学发光分析仪所用底物的精密度验证结果
二、测量范围验证：
1验证意义：测量范围是指系统最终输出值(例如浓度或活性)与被测分析物浓度或活性成比例的范围。测量范围的验证既测定系统浓度曲线接近直线的程度，它反映整个系统的输出特性，是非常重要的技术指标，直接影响着高浓度样本结果的准确性。如果测量范围小，在临床测量过程中就会导致高浓度的人体样本结果偏低，延误病人的诊断和治疗。
2验证方法：本实施例按照美国的国家临床实验室标准委员会文件ep6-a--《定量分析方法的线性评价》，选取无溶血、脂血或黄疸等明显干扰项且在本院检测过的接近罗氏公司检测项目的测量范围上限及下限的临床标本血清各一例，按照1l、0.8l+0.2h、0.6l+0.4h、0.4l+0.6h、0.2l+0.8h以及1h的体积关系配制，形成一系列6个评价样本，不同浓度的样本在一个分析批次内检测4次。以理论浓度为x，测量平均值为y，计算回归方程y＝bx+a,若相关系数r≥0.975，斜率b在0.97～1.03范围内，截距a与0无显著性差异，则判断验证符合要求。将上述每个项目分别验证其测量范围，统计结果如表2所示，分项结果如表3-7所示。
表2电化学发光分析仪所用底物的测量范围验证结果
表3tsh测量值验证
表4e2测量范围验证
表5prog测量范围验证
表6afp测量范围验证
表7tpsa测量范围验证
通过以上表格验证数据及图1-5所示，本发明的底物测量范围达到罗氏原装底物的测量范围，检测高浓度的样本时仍能够得到准确的结果，给临床提供正确的诊断信息，为病人的诊治提供保障。
三、准确性验证：
1验证方法：按照美国的国家临床实验室标准委员会(简称nccls)文件ep9-a2--《用病人样本进行方法学比较和评估定量分析方法之间的偏倚比对分析》，选取新鲜病人标本，其浓度选择按照ep9-a2文件中方法对比试验数据分布建议表的要求，覆盖检测范围，特别注意地覆盖了医学决定水平，并且有足够的量进行重复性检测。血清样本的罗氏原装底物和本发明底物测定结果的统计分析按照ncclsep9-a2的要求在excel上编制程序进行分析，将40个标本分别用罗氏原装底物测定后再用本发明的底物进行测定，测定结果(xij,yij)输入x、y列，自动计算并绘制成相应的图表。主要内容有(1)进行方法内离群点的检验；(2)比对方法(x)测定范围的检验，如r≥0.975(或r2≥0.95)，则认为x取值范围合适，直线回归统计的斜率和截距可靠；(3)计算回归方程y＝bx+a；(4)计算方法间的系统误差：根据临床需要，将上述6个具有代表性的项目的医学决定水平浓度(xc)代入回归方程，计算本发明的底物测定结果(y)与罗氏原装结果(x)之间的系统误差(se)，se＝︱yc-xc︱＝︱(b-1)xc+a︱；se％＝(se/xc)×100％。按照卫生部临床检验中心室间质量评价标准允许总误差的二分之一(1/2tea)为判断标准，如果se％<1/2tea，则判断为本发明的底物结果与罗氏原装底物结果准确性具有一致性，能够满足临床需要。
表8ths准确性验证
tsh的医学决定水平为4.2μiu/ml，由表8求得此时系统偏差se为0.197μiu/ml，se％为4.68，如图6所示，小于该项目的1/2tea(12.5％)，判断为本实施例的底物结果与罗氏原装底物结果准确性具有一致性，能够满足临床需要。
表9e2准确性验证
e2的医学决定水平为607pmol/l，此时系统偏差se为32.338pmol/l，se％为5.33，如图7所示，小于该项目的1/2tea(12.5％)，判断为本发明的底物结果与罗氏原装底物结果准确性具有一致性，能够满足临床需要。
表10prog准确性验证
prog的医学决定水平为4.7nmol/l，此时系统偏差se为0.395nmol/l，se％为8.41，如图8所示，小于该项目的1/2tea(12.5％)，判断为本发明的底物结果与罗氏原装底物结果准确性具有一致性，能够满足临床需要。
表11afp准确性验证
afp的医学决定水平为7ng/ml，此时系统偏差se为0.488ng/ml，se％为6.97，如图9所示，小于该项目的1/2tea(12.5％)，判断为本发明的底物结果与罗氏原装底物结果准确性具有一致性，能够满足临床需要。
表12tpsa准确性验证
tpsa的医学决定水平为4ng/ml，此时系统偏差se为0.186ng/ml，se％为4.65，如图10所示，小于该项目的1/2tea(12.5％)，判断为本发明的底物结果与罗氏原装底物结果准确性具有一致性，能够满足临床需要。
从上述5个具有代表性的项目准确性验证结果分析，分析准确性均能达到要求，高浓度人体样本结果也准确无误，避免了由于三丙胺浓度低可能导致的结果不准确，表明本发明底物准确性精准可靠。
四、底物的保存及稳定性验证：将实施例底物中的发光缓冲液、测量池清洗液和预清洗液，室温放置24个月后，其各成分含量无变化，外观仍保持无色透明，无沉淀，无霉变，经抽样验证上述各指标仍符合规定。表明本发明电化学发光免疫分析系统的发光缓冲液、测量池清洗液和预清洗液的稳定性可达24个月以上。
综合分析，使用本发明的底物无需校准，放在罗氏电化学发光分析仪上直接使用，检测范围与原装一致，达到检测上限浓度的高浓度的人体样本也不会产生钩状效应，结果准确可靠，从而避免了漏诊，具有重要的临床价值；稳定期24个月，成本比原装降低60％，具有广阔的市场价值。
虽然本发明已作了详细描述，但对本领域技术人员来说，在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。此外，应当理解的是，本发明记载的各方面、不同具体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体实施方式中，那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合，这是将由本领域技术人员所能理解的。此外，本领域技术人员将会理解，前面的描述仅是示例的方式，并不旨在限制本发明。