一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法与流程

本发明涉及色谱-质谱联用技术领域，具体涉及一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法。

背景技术：

玉米须，别名玉麦须、玉蜀黍蕊、棒头毛，是禾本科植物玉蜀黍Zeamays L.的干燥花丝和柱头，在《中华本草》、《全国中草药汇编》等药学论著中均有记载。现常用于药茶，药膳中，作为糖尿病、高血压的辅助治疗药物。玉米须味甘、淡，性平，不仅入阳明胃经，而且归肾、肝、胆经，传统用于利水消肿、清肝利胆。

我国是玉米产量大国，所以玉米须是一种来源丰富、价格低廉且易于采集的中药材。而且，现代药理研究结果表明，玉米须有降血糖，抗癌、抑菌、增强免疫功能、利尿、降血压等作用。化学研究表明，黄酮类成分是玉米须的重要组成成分，且对药理活性的发挥起到重要作用。如异鼠李素具有抗脂质氧化、降低血清胆固醇及甘油三酯等作用，且能明显抑制肿瘤细胞DNA生长和增殖，对人体多种癌细胞株有杀伤作用；槲皮素对去甲肾上腺促人血管平滑肌细胞增殖有抑制作用；木犀草苷对心肌细胞损伤具有保护作用，并且可以抑制肿瘤细胞的增殖作用；而木犀草素近期发现其对肿瘤干细胞增殖具有显著影响；刺芒柄花素对抗癌、改善骨质疏松和改善妇女更年期症状等有一定的作用。由此可见，对玉米须中黄酮类成分进行质量控制对其合理应用具有重要意义。

现有的检测技术中，液相色谱和质谱联用技术应用广泛，但是对于玉米须中含有的黄酮类成分鲜有报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，本方法建立了超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)方法，同时测定玉米须中黄酮类成分含量，该方法准确性强、灵敏度高、分离速度快，能够定性定量测定玉米须中的黄酮类成分含量。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，包括以下步骤：

步骤1：玉米须中黄酮类成分提取

(1)将玉米须粉末加入乙醇水溶液浸泡12h以上，振摇，得到混合均匀的溶液；

(2)将混合均匀的溶液回流1～6h后，室温冷却，得到玉米须乙醇水溶液，其质量浓度为0.01～0.03g/ml；

(3)将玉米须乙醇水溶液涡旋混匀，取上清液采用微孔滤膜过滤，得到检测液；

步骤2：测试

取检测液进行超高效液相色谱串联质谱测试，对测试结果进行分析，采用外标法得到玉米须中黄酮类成分含量；

其中，

(1)超高效液相色谱的测试条件为：

采用Thermo Hypersil GOLD色谱柱，选用流动相进行等度或梯度洗脱；进样量为5～10μL；柱温为25～35℃；

所述的流动相为甲醇-水、甲醇-0.1％甲酸水溶液、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水、乙腈-水-冰醋酸中的一种；

(2)质谱的测试条件为：采用电喷雾离子源，多离子扫描模式下MRM检测方式；毛细管电压为1.0～5.0kV，离子源温度为100～200℃，脱溶剂温度为300～500℃，脱溶剂气流量为600～700L·h^-1，锥孔气流量为30～800L·h^-1；碰撞气为氩气，压力为2×10^-3～4×10^-3mbar；准确质量校正采用NaCsI进行校正。

所述的步骤1(1)中，所述的振摇优选为超声振摇，所述的乙醇水溶液中乙醇的质量浓度为40～60wt％。

所述的步骤1(2)中，所述的混合均匀的溶液回流后，为了保证溶液的质量浓度范围，增加回流损失的部分乙醇。

所述的步骤1(3)中，所述的涡旋混匀采用的设备为旋涡混合器。

所述的步骤1(3)中，所述的微孔滤膜的孔径为0.2μm或0.22μm或0.45μm。

所述的步骤2(1)中，所述的Thermo Hypersil GOLD色谱柱，优选型号为柱长为100mm，内径为2.1mm的Thermo Hypersil GOLD色谱柱，色谱柱中填料粒径为1.9μm。

所述的步骤2(1)中，所述的洗脱优选为梯度洗脱，梯度洗脱按一定程序梯度性地改变洗脱液的比例，数据更准确，结果更可信。梯度洗脱程序：0-6min：50％B-20％B，6-6.01min：20％B-50％B，6.01-8.5min：50％B；流速：0.3mL·min^-1；

所述的步骤2(1)中，所述的流动相中，A液B液可以互换，混合比例为任意比例。

所述的步骤2(1)中，所述的流动相优选为甲醇-水-冰醋酸。

所述的步骤2(1)中，当流动相为甲醇-0.1％甲酸水时，A相为甲醇；B相为0.1wt.％甲酸-水。

所述的步骤2(1)中，在超高效液相色谱分析时，各峰与相邻峰的分离度均≥1.5，理论板数测得成分峰计算均≤3000。

所述的步骤2(2)中，所述的多离子扫描模式优选为负离子扫描模式。

所述的测定玉米须中黄酮类成分含量中，玉米须中黄酮类成分为木犀草苷、槲皮素、木犀草素、异鼠李素和刺芒柄花素。

本发明的一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，相比于现有技术，其有益效果在于：

1.本发明的UPLC-MS/MS能够同时测定玉米须中黄酮类成分含量，该方法中，黄酮类成分在各自的质量浓度范围内呈现良好的线性关系、加样回收率高、该方法简便、准确、安全、快捷、精密度良好，为玉米须中药材的质量控制提供方法依据，为开发新药用中药提供了一些有益的探索。

2.采用本发明的玉米须中黄酮类成分的提取方法，在12h内成分稳定。

附图说明

图1为本发明实施例1中检测液和对照品溶液中的木犀草苷(Cyna)色谱图；其中，(a)为对照品溶液，(b)为检测液。

图2为本发明实施例1中检测液和对照品溶液中的木犀草素(Quer)色谱图；其中，(a)为对照品溶液，(b)为检测液。

图3为本发明实施例1中检测液和对照品溶液中的槲皮素(Lute)色谱图；其中，(a)为对照品溶液，(b)为检测液。

图4为本发明实施例1中检测液和对照品溶液中的异鼠李素(Isor)色谱图；其中，(a)为对照品溶液，(b)为检测液。

图5为本发明实施例1中检测液和对照品溶液中的刺芒柄花素(Form)色谱图；其中，(a)为对照品溶液，(b)为检测液。

图6为本发明实施例1中木犀草苷(Cyna)二级质谱图；

图7为本发明实施例1中木犀草素(Quer)二级质谱图；

图8为本发明实施例1中槲皮素(Lute)二级质谱图；

图9为本发明实施例1中异鼠李素(Isor)二级质谱图；

图10为本发明实施例1中刺芒柄花素(Form)二级质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

以下实施例，除特殊说明，百分比均为质量百分比。

以下实施例，除特殊说明，所用的设备和原料均为市购。

以下实施例，采用的槲皮素(Quercetin，Quer)为自制，采用的方法为现有技术，用HPLC归一化法测得质量浓度大于98.5％，通过核磁共振和质谱数据确证。

以下实施例，色谱分析采用Aglient 1290超高效液相色谱仪(Aglient,CA,USA)；质谱分析采用AB SCIEX Triple Quad^TM3500质谱仪(Foster City,CA,USA)，Analyst 1.6.3工作站。

实施例1

一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，包括以下步骤：

步骤1：玉米须中黄酮类成分提取

(1)称取玉米须粉末0.5g，置于圆底烧瓶中，加入50wt％的乙醇水溶液25mL，称量总质量m₁，浸泡12h，振摇混匀，得到混合均匀的溶液；

(2)将混合均匀的溶液回流1h后，室温冷却，称量总质量m₂，向圆底烧瓶中补入(m₁-m₂)质量的乙醇，得到玉米须乙醇水溶液；玉米须乙醇水溶液的质量浓度为0.02g/ml；

(3)将玉米须乙醇水溶液采用旋涡混合器进行涡旋混匀，用高速离心机进行离心，取上清液采用0.22μm微孔滤膜过滤，得到检测液；

步骤2：测试

测试前，进行标准曲线的制备

(1)对照品溶液的配制

a.称取：

取木犀草苷(Cyna)、木犀草素(Quer)、槲皮素(Lute)、异鼠李素(Isor)、刺芒柄花素(Form)对照品适量，精密称定，加甲醇分别配制成质量浓度为0.5009mg/mL的Cyna甲醇溶液，0.5018mg/mL的Quer甲醇溶液，0.2014mg/mL的Lute甲醇溶液，0.2005mg/mL的Isor甲醇溶液，0.1003mg/mL的Form甲醇溶液，将五种对照品混合，得到混合储备液I。

b.定容：

精密量取混合储备液I 1.0mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照溶液II。

精密量取混合储备液II 1.0mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。

(2)标准曲线的制备

分别精密量取混合储备液II 0.1mL、0.2mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、10.0mL，分别置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列标准溶液，分别进样5μL，以标准溶液浓度(ρ)为横坐标，色谱峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，其中，标准曲线的相关系数见以下表1所示。

表1标准曲线和相关系数

结果表明，Cyna，Quer，Lute，Isor，Form分别各自的质量浓度范围内线性关系良好。

(3)对玉米须中黄酮类成分含量进行检测分析

取步骤1中制备的检测液5μL进行超高效液相色谱串联质谱测试，对测试结果进行分析，以外标法得到玉米须中黄酮类成分含量；

其中，

①超高效液相色谱的测试条件为：

采用柱长为100mm，内径为2.1mm的Thermo Hypersil GOLD色谱柱，色谱柱中填料粒径为1.9μm；

流动相：A相为甲醇；B相为0.1wt.％甲酸-水；采用梯度洗脱程序：0-6min：50％B-20％B，6-6.01min：20％B-50％B，6.01-8.5min：50％B；流速：0.3mL·min^-1进行梯度洗脱；进样量为5μL；柱温为30℃；各峰与相邻峰的分离度均≥1.5，理论板数测得成分峰计算均≤3000。

检测液和对照品溶液在上述条件下所得的各个黄酮类成分的色谱图分别见图1～图5。其中，检测液和对照品溶液中的木犀草苷(Cyna)色谱图见图1；图1中，(a)为对照品溶液，(b)为检测液。检测液和对照品溶液中的木犀草素(Quer)色谱图见图2；图2中，(a)为对照品溶液，(b)为检测液。检测液和对照品溶液中的槲皮素(Lute)色谱图见图3；图3中，(a)为对照品溶液，(b)为检测液。检测液和对照品溶液中的异鼠李素(Isor)色谱图见图4；图4中，(a)为对照品溶液，(b)为检测液。检测液和对照品溶液中的刺芒柄花素(Form)色谱图见图5；图5中，(a)为对照品溶液，(b)为检测液。

通过检测液和对照品溶液的色谱图对比分析，确定分离出来的确实是所得到的黄酮类成分。

②质谱的测试条件为：采用电喷雾离子源，负离子扫描模式下MRM检测方式；毛细管电压为3.0kV，离子源温度为150℃，脱溶剂温度为400℃，脱溶剂气流量为700L·h^-1，锥孔气流量为50L·h^-1；碰撞气为氩气，压力为2.95×10^-3mbar；准确质量校正采用NaCsI进行校正；

玉米须中5种黄酮类化合物，根据质谱数据确定待测物的定量参数如下表：

表2根据质谱数据确定待测物的定量参数

玉米须中5种黄酮类化合物的二级质谱图如图6～图10所示。其中，木犀草苷(Cyna)二级质谱图见图6；木犀草素(Quer)二级质谱图见图7；槲皮素(Lute)二级质谱图见图8；异鼠李素(Isor)二级质谱图见图9；刺芒柄花素(Form)二级质谱图见图10。

经过对本实施例的测试结果进行分析，采用外标法得到玉米须中黄酮类成分含量见表3。

实施例2

一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，同实施例1，不同之处在于，玉米须取自不同玉米值珠生长的玉米须样品。得到玉米须中黄酮类成分含量见表3。

实施例3

一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，同实施例1，不同之处在于，玉米须取自不同玉米值珠生长的玉米须样品。得到玉米须中黄酮类成分含量见表3。

实施例4

一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，同实施例1，不同之处在于，玉米须取自不同玉米值珠生长的玉米须样品。得到玉米须中黄酮类成分含量见表3。

实施例5

一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，同实施例1，不同之处在于，玉米须取自不同玉米值珠生长的玉米须样品。得到玉米须中黄酮类成分含量见表3。

实施例6

一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，同实施例1，不同之处在于，玉米须取自不同玉米值珠生长的玉米须样品。得到玉米须中黄酮类成分含量见表3。

实施例7

一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，同实施例1，不同之处在于，玉米须取自不同玉米值珠生长的玉米须样品。得到玉米须中黄酮类成分含量见表3。

实施例8

一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，同实施例1，不同之处在于，玉米须取自不同玉米值珠生长的玉米须样品。得到玉米须中黄酮类成分含量见表3。

实施例9

一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，同实施例1，不同之处在于，玉米须取自不同玉米值珠生长的玉米须样品。得到玉米须中黄酮类成分含量见表3。

实施例10

一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，同实施例1，不同之处在于，玉米须取自不同玉米值珠生长的玉米须样品。得到玉米须中黄酮类成分含量见表3。

表3不同玉米值珠生长的玉米须样品中的黄酮类成分含量

实施例11

一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，包括以下步骤：

步骤1：玉米须中黄酮类成分提取

(1)称取玉米须粉末0.25g，置于圆底烧瓶中，加入40wt％的乙醇水溶液25mL，称量总质量m₁，浸泡16h，超声振摇混匀，得到混合均匀的溶液；

(2)将混合均匀的溶液回流1h后，室温冷却，称量总质量m₂，向圆底烧瓶中补入(m₁-m₂)质量的乙醇，得到玉米须乙醇水溶液；

(3)将玉米须乙醇水溶液采用旋涡混合器进行涡旋混匀，用高速离心机进行离心，取上清液采用0.22μm微孔滤膜过滤，得到检测液；

步骤2：测试

对玉米须中黄酮类成分含量进行检测分析

取检测液5μL进行超高效液相色谱串联质谱测试，对测试结果进行分析，以外标法得到玉米须中黄酮类成分含量；

其中，①超高效液相色谱的测试条件为：

采用柱长为100mm，内径为2.1mm的Thermo Hypersil GOLD色谱柱，色谱柱中填料粒径为1.9μm；

流动相：A相为乙腈；B相为0.4wt.％冰醋酸-水；采用梯度洗脱程序：0-6min：50％B-20％B，6-6.01min：20％B-50％B，6.01-8.5min：50％B；流速：0.3mL·min^-1进行梯度洗脱；进样量为5μL；柱温为25℃；各峰与相邻峰的分离度均≥1.5，理论板数测得成分峰计算均≤3000。

②质谱的测试条件为：采用电喷雾离子源，正离子扫描模式下MRM检测方式；毛细管电压为1.0kV，离子源温度为100℃，脱溶剂温度为300℃，脱溶剂气流量为600L·h^-1，锥孔气流量为30L·h^-1；碰撞气为氩气，压力为2×10^-3mbar；准确质量校正采用NaCsI进行校正。

实施例12

一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，包括以下步骤：

步骤1：玉米须中黄酮类成分提取

(1)称取玉米须粉末0.75g，置于圆底烧瓶中，加入60wt％的乙醇水溶液25mL，称量总质量m₁，浸泡24h，振摇混匀，得到混合均匀的溶液；

(2)将混合均匀的溶液回流6h后，室温冷却，称量总质量m₂，向圆底烧瓶中补入(m₁-m₂)质量的乙醇，得到玉米须乙醇水溶液；

(3)将玉米须乙醇水溶液采用旋涡混合器进行涡旋混匀，用高速离心机进行离心，取上清液采用0.20μm微孔滤膜过滤，得到检测液；

步骤2：测试

对玉米须中黄酮类成分含量进行检测分析

取检测液5μL进行超高效液相色谱串联质谱测试，对测试结果进行分析，以外标法得到玉米须中黄酮类成分含量；

其中，①超高效液相色谱的测试条件为：

采用柱长为100mm，内径为2.1mm的Thermo Hypersil GOLD色谱柱，色谱柱中填料粒径为1.9μm；

流动相：A相为甲醇；B相为0.4wt.％冰醋酸-水；采用梯度洗脱程序：0-6min：50％B-20％B，6-6.01min：20％B-50％B，6.01-8.5min：50％B；流速：0.3mL·min^-1进行梯度洗脱；进样量为5μL；柱温为35℃；各峰与相邻峰的分离度均≥1.5，理论板数测得成分峰计算均≤3000。

②质谱的测试条件为：采用电喷雾离子源，正离子扫描模式下MRM检测方式；毛细管电压为5.0kV，离子源温度为200℃，脱溶剂温度为500℃，脱溶剂气流量为700L·h^-1，锥孔气流量为80L·h^-1；碰撞气为氩气，压力为4×10^-3mbar；准确质量校正采用NaCsI进行校正。

实施例13

一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，一种测定玉米须中黄酮类成分含量的方法，包括以下步骤：

步骤1：玉米须中黄酮类成分提取

(1)称取玉米须粉末0.3g，置于圆底烧瓶中，加入50wt％的乙醇水溶液25mL，称量总质量m₁，浸泡16h，超声振摇混匀，得到混合均匀的溶液；

(2)将混合均匀的溶液回流2h后，室温冷却，称量总质量m₂，向圆底烧瓶中补入(m₁-m₂)质量的乙醇，得到玉米须乙醇水溶液；

(3)将玉米须乙醇水溶液采用旋涡混合器进行涡旋混匀，用高速离心机进行离心，取上清液采用0.45μm微孔滤膜过滤，得到检测液；

步骤2：测试

对玉米须中黄酮类成分含量进行检测分析

取检测液5μL进行超高效液相色谱串联质谱测试，对测试结果进行分析，以外标法得到玉米须中黄酮类成分含量；

其中，①超高效液相色谱的测试条件为：

采用柱长为100mm，内径为2.1mm的Thermo Hypersil GOLD色谱柱，色谱柱中填料粒径为1.9μm；

流动相：甲醇-水溶液，按质量比，甲醇：水＝55：45，采用该流动相进行等度洗脱，流速为0.3mL/min；进样量为5μL；柱温为30℃；各峰与相邻峰的分离度均≥1.5，理论板数测得成分峰计算均≤3000。

②质谱的测试条件为：采用电喷雾离子源，负离子扫描模式下MRM检测方式；毛细管电压为3.0kV，离子源温度为150℃，脱溶剂温度为400℃，脱溶剂气流量为600L·h^-1，锥孔气流量为400L·h^-1；碰撞气为氩气，压力为3×10^-3mbar；准确质量校正采用NaCsI进行校正。

试验例1

对采用实施例1制备的检测液的稳定性进行测试，其方法为：

取新制备的同一份检测液，分别在室温放置0、2、4、6、8、12h后进样，记录色谱图，其中，木犀草苷(Cyna)的峰面积的RSD为1.3％、木犀草素(Quer)的峰面积的RSD为0.1％、槲皮素(Lute)的峰面积的RSD为2.0％、异鼠李素(Isor)的峰面积的RSD为1.8％、刺芒柄花素(Form)的峰面积的RSD为1.9％，证明通过实施例1制备的玉米须中的检测液在12h内稳定，说明该提取方法有效。

试验例2

称取已知量的玉米须样品9份，每份0.25g，精密称定，分别加入对照品溶液0.5，1.0，2.0mL，每个样品平行3份，采用实施例1步骤1中，玉米须样品处理方法，制备检测液，以实施例1的色谱条件下进样分析，计算Cyna，Quer，Lute，Isor，Form的量，计算回收率，其中，木犀草苷(Cyna)的平均回收率为96.2％(RSD为2.4％)、木犀草素(Quer)的平均回收率为100.6％(RSD为2.9％)、槲皮素(Lute)的平均回收率为94.8％(RSD为2.0％)、异鼠李素(Isor)的平均回收率为95.8％(RSD为2.4％)、刺芒柄花素(Form)的平均回收率为96.6％(RSD为2.2％)。

试验例3

按照实施例1中，步骤2(1)中对照品溶液的配制方法，配制对照品溶液；

精密吸取对照品溶液5μl，重复进样6次，记录色谱图，测量峰面积，Cyna的峰面积RSD为1.8％、Quer的峰面积RSD为0.5％、的峰面积RSD为1.2％、Isor的峰面积RSD为1.6％、Form的峰面积RSD为1.9％，表明仪器精密度良好。

试验例4

以实施例1步骤1的方法，配制6组检测液，进样，记录色谱图，计算Cyna的RSD为1.0％、Quer的RSD为2.0％、Lute的RSD为2.0％、Isor的RSD为1.2％、Form的RSD为1.4％，表明方法精密度良好。