本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种利用基于金二聚体基底的竞争型的纳米传感器超灵敏检测凝血酶的方法。
背景技术:
凝血酶(thrombin)是一种重要的丝氨酸蛋白质水解酶,由两条肽链组成,肽链之间以二硫键连接。凝血酶通过将血液中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白,具有调控凝血、促进血液循环等作用。凝血酶作为一种重要的多功能活性蛋白,在血栓症、血管增生、肿瘤生长和转移等都发挥着关键的作用,同时凝血酶也常常被用作治疗剂和生物标记物。目前检测凝血酶的方法主要有比色法、荧光法和电化学法,但这些方法或多或少存在着一些不足,比如灵敏度不佳,操作复杂,无法达到现代医学要求的衡量检测等。因此建立快速、简单、超灵敏度检测凝血酶的方法具有非常重要的意义。
表面增强拉曼光谱(surfaceenhancedramanscattering,sers)技术是一种新颖的光谱标记方法,是当前的一个研究热点。该技术一方面具有拉曼光谱的优点,如光的信号不易漂白、对生物细胞和组织的损伤较小、光谱信息丰富且光谱的谱峰较窄极易区分等;另一方面,它弥补了传统拉曼信号较弱、不利于检测的缺点。sers的增强效应使光谱检测具有超高的灵敏度,目前已实现单分子水平的分析研究。sers效应一般产生于粗糙的纳米金属表面或者纳米金属之间,故纳米技术为构建sers纳米探针提供了丰富的技术手段。基于sers技术而发展起来的纳米探针在生物成像、蛋白质检测、肿瘤识别等诸多领域展现出可观的应用前景。
技术实现要素:
为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的目的在于提供一种利用基于金二聚体基底的竞争型的纳米传感器超灵敏检测凝血酶的方法。所用纳米传感器是采用金二聚体纳米粒子组装体集合免疫磁珠捕获技术的纳米传感器。
本发明通过拉曼信号探针和磁性捕获探针的免疫识别作用以及凝血酶的竞争反应,实现对样品中的凝血酶进行快速、高灵敏度的定量分析,解决现有技术中样品处理复杂、灵敏度不够等问题。
本发明的方法具有灵敏度高、特异性强、检测过程简单、准确定量检测等特点。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种利用基于金二聚体基底的竞争型的纳米传感器超灵敏检测凝血酶的方法,包括如下步骤:
首先,将bpe与金纳米颗粒结合形成金二聚体,并与tba其中一段互补配对的适配体aptamer-1反应,得到拉曼信号探针;然后再与修饰有凝血酶适配体tba的磁性纳米颗粒进行混合反应,得到纳米传感器体系;当存在待测物凝血酶时,该纳米传感器体系的结构会被竞争打断,引起体系中上清液的拉曼信号(拉曼信号探针)的变化,基于此实现对凝血酶含量的检测。
具体包括如下步骤:
(1)将表面修饰有羧基的磁性纳米颗粒用活化剂活化羧基,随后加入修饰了氨基的凝血酶适配体tba“发卡”结构,反应即得捕获探针;
(2)选用bpe作为拉曼信号分子,通过该分子两端的吡啶基与金纳米颗粒结合形成金二聚体,并适时加入硝酸银溶液终止反应,防止形成金多聚体,bpe既作为拉曼信号分子,又作为二聚体的中间连接物;
(3)先将与tba其中一段互补配对的适配体aptamer-1用tcep活化,通过适配体aptamer-1上的巯基与步骤(2)中的金二聚体反应(au-s),制备得到拉曼信号探针;
(4)将步骤(1)中的捕获探针和步骤(3)中的拉曼信号探针混合反应,利用拉曼信号探针上的适配体打开捕获探针上的tba“发卡”结构,通过互补序列的杂交形成捕获探针-拉曼信号探针的纳米传感器体系;
(5)用tris-hcl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲溶液配制凝血酶溶液,并稀释成一组具有浓度梯度的标准样品液;
(6)取相同体积的步骤(4)中的纳米传感器体系,分别加入步骤(5)中相同体积、不同浓度的凝血酶标准样品液,室温中孵育,磁分离后对上清液中游离的拉曼信号探针进行信号采集,由于凝血酶会竞争的与凝血酶适配体tba反应,随着凝血酶浓度的增加,纳米传感器体系会逐渐的被打断,会导致上清液中的拉曼信号逐渐增加;
(7)根据凝血酶浓度与拉曼信号强度(i1616/i520)的对应关系建立标准曲线,从而应用拉曼信号对凝血酶进行定量检测。
在上述检测凝血酶的方法中:
所述的凝血酶为人凝血酶(α-thrombin);
步骤(1)中所述的表面修饰有羧基的磁性纳米颗粒为表面修饰有羧基的四氧化三铁fe3o4,其粒径优选为200~300nm;
步骤(1)所述的活化剂优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs);
步骤(1)中所述的凝血酶适配体tba序列为:
5′-tgtcagtggggttggacgggatggtgcctgactctc-(ch2)7-nh2-3′;
步骤(1)中所述的凝血酶适配体tba浓度优选为10~100μm;更优选为100μm。
步骤(2)中所述的bpe是1,2-二(4-吡啶基)乙烯;
步骤(2)中所述的金纳米颗粒的平均粒径优选为25~35nm;更优选为30nm;
步骤(2)中所述的金纳米颗粒的溶液浓度为0.5~1.5mm;更优选为1mm。
步骤(3)中所述的tcep是三(2-羧乙基)膦,作用是活化凝血酶适配体tba;
步骤(3)中所述的适配体aptamer-1的浓度优选为10~100μm;更优选为100μm。
步骤(3)中所述的适配体aptamer-1序列为:
5′-ggcaccatcccgtccaacccca-(ch2)6-sh-3′;
步骤(4)中所述的捕获探针和拉曼信号探针体积混合比例为10:(6~8);更优选为10:8。
步骤(5)中所述的tris-hcl缓冲溶液里包含50mmnacl、5mmkcl、5mmmgcl2;
步骤(5)中所述的一组具有浓度梯度的标准样品液为0m、1fm、10fm、100fm、1pm、10pm、100pm、1nm、10nm、100nm以及1μm,其中0m为空白对照;
步骤(6)中所述的纳米传感器体系与凝血酶标准样品液的体积比值为4.5~5.5;优选为5。
步骤(6)中所述的磁分离是指利用磁场物理作用分离磁性结合物与上清液,相比于传统的清洗固相基底来去除残留物的步骤,此方法更加高效;
步骤(6)中所述的信号是通过显微拉曼光谱仪测得:所述的显微拉曼光谱仪的操作条件优选为激发光源是波长为632.8nm的he-ne激光器,到达样品的激光功率为1mw,信号收集时间为30~40s(优选为30s);
步骤(6)中所述的信号是选取拉曼信号分子的特征拉曼谱峰(1616cm-1)作为定量峰,并以凝血酶浓度对该谱峰光谱强度作图,并以此绘制标准曲线;
步骤(7)中所述的i1616/i520,其中i1616是bpe分子在1616cm-1处的峰强,i520是用于校准的硅片基底的特征峰(520cm-1处)的强度。
本发明的机理:在收集时间一定的情况下,对于同一种拉曼信号分子,信号强度与拉曼信号分子的浓度呈正相关;正是在此基础上实现了定量检测。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明将免疫光谱标记处理的金二聚体用于凝血酶的定量检测,将拉曼分子的信号强度和待测物质的浓度联系起来,类似于朗伯比尔定律,从而实现对凝血酶的定量检测;
(2)本发明采用的拉曼信号分子为bpe,通过该分子两端的吡啶基将金纳米颗粒连接在一起,形成金二聚体,将大大增强信号分子的强度;
(3)本发明基于金二聚体的拉曼信号探针与捕获探针形成的纳米传感器体系,可以对凝血酶进行快速定量检测,克服了传统方法的不足,同时结合磁性捕获探针的富集作用,通过检测上清液而得到拉曼信号;
(4)本发明是通过检测溶液的拉曼光谱信号得到相应的结果,相比于传统的检测固相基底的方法,溶液中的拉曼光谱信号监测数据更加稳定可靠且可大量重复;
(5)本发明检测稳定性好,检测灵敏度高,得到了一个宽的检测区间(1fm~1μm)和低的检测限(1fm);
(6)本发明操作简单,拉曼信号探针与捕获探针都可以提前准备好并制得纳米传感器体系,操作时只需将纳米传感器体系依次加入到待测样品中反应,反应结束后通过磁分离可以马上进行检测:收集时间30s,然后立刻从标准曲线上读出浓度,从而实现快速定量检测;这可以满足食品安全和环境监测部门的要求,具有广泛的实用性。
附图说明
图1是快速定量检测凝血酶的方法流程示意图。
图2是制备的金纳米颗粒(a)、金二聚体(b)、金多聚体(未加硝酸银溶液终止反应)(c)和拉曼信号探针(d)的透射电镜图。
图3是使用不同浓度凝血酶标准溶液得到的拉曼信号光谱图。
图4是标准溶液中凝血酶检测的曲线图;其中,横坐标代表凝血酶的浓度(横坐标是浓度的log10),纵坐标代表不同浓度凝血酶时的拉曼信号强度(i1616/i520)。
图5是凝血酶特异性检测的拉曼信号强度图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
下面实施例中,未注明具体条件和环境的实验方法,通常按照常规条件,或制造厂商所建议的条件。本发明中bpe为拉曼信号分子1,2-二(4-吡啶基)乙烯;pbs表示磷酸盐缓冲液;tris-hcl表示三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液;edc表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚氨盐酸盐;nhs表示n-羟基琥珀酰亚胺;tcep表示三(2-羧乙基)膦。
快速定量检测凝血酶的方法流程示意图,如图1所示。
实施例1:
(1)、金纳米颗粒的制备
在不断搅拌下将100ml1mm的氯金酸(haucl4)溶液加热至沸腾,然后加入6ml38.8mm的柠檬酸三钠水溶液。此时溶液的颜色变化是:淡黄-无色-黑色-紫色-深红色,等溶液变成深红色继续加热回流15~20min。最后冷却至常温,制备得到30nm的金纳米颗粒,图2a是理想条件下得到的金纳米颗粒。
(2)、金二聚体纳米粒子的制备
将制得的金纳米颗粒(浓度约为1mmol/l)离心一次(8000rpm、10min),然后用三蒸水重悬(ph=7)待用;取上述1ml金纳米颗粒,与30μl1mmbpe反应10min左右,在金纳米颗粒的颜色变化之前加入20μl2mm硝酸银溶液终止反应(10min),反应结束后离心(4000rpm、20min),三蒸水重悬,最后得到金二聚体纳米粒子,图2b是理想条件下合成的金二聚体纳米粒子;图2c是未加硝酸银溶液终止反应得到的金多聚体。
(3)、拉曼信号探针的制备
适配体aptamer-1通过盐沉积法修饰到金二聚体纳米粒子表面:首先,将50μl100μm适配体aptamer-1用3.5μl100μm新配置的tcep溶液活化10分钟,然后将活化后的aptamer-1加入到上述三蒸水重悬的金二聚体纳米粒子中。常温下孵育12h,加入100μl100mm的pbs缓冲液,接着在48h内将1m的nacl溶液加入直至终浓度为0.1mm,最后,以4000rpm离心20分钟,去掉上清液,底物用0.1mtris-hcl缓冲液重悬,最终得到的拉曼信号探针保存在4℃环境下,图2d是理想条件下得到的拉曼信号探针。
(4)、捕获探针的制备
取100μl表面修饰有羧基的四氧化三铁fe3o4,购自阿拉丁试剂(上海)有限公司,用pbs清洗两次,最后用pbs定容至500μl。然后配制edc(4mg/ml)和nhs(1mg/ml),首先向上述磁珠溶液加入30μl的edc溶液,30min后加入同样体积的nhs溶液,活化90min。然后用tris-hcl缓冲液清洗磁珠两次,之后用500μltris-hcl重悬,随后加入50μl(100μm)凝血酶适配体tba,反应2h后用tris-hcl洗涤去除多余tba,重悬备用,得到捕获探针。
(5)、标准样品溶液的制备
选择10个浓度的凝血酶标准溶液,分别为0mol、1fm、10fm、100fm、1pm、10pm、100pm、1nm、10nm、100nm以及1μm,其中0mol为空白对照。
(6)、纳米传感器制备以及凝血酶的检测
取100μl步骤(4)中制备的捕获探针和80μl步骤(3)中制备好的拉曼信号探针混合反应2h,利用捕获探针上的tba与拉曼信号探针上互补序列的杂交,形成“捕获探针-拉曼信号探针”的纳米传感器体系;随后,取每一份上述得到的纳米传感器体系,分别加入20μl步骤(5)中不同浓度的凝血酶标准溶液,由于凝血酶会竞争性的与凝血酶适配体tba反应,随着凝血酶浓度的增加,纳米传感器体系会逐渐的被打断,会导致上清液中的拉曼信号逐渐增加。
(7)、拉曼信号的测量
利用磁铁的磁场作用分离底物,保留上清液。用日本nipponopticalsystem公司的显微拉曼光谱仪,对上清液中的拉曼信号探针进行信号采集,激发光源是波长为632.8nm的he-ne激光器,到达样品的激光功率为1mw,信号收集时间为30s。信号采集完毕后通过origin软件对数据进行基线处理,得到清晰直观的sers光谱图(如图3)。
从图4中可以明显地看到,随着样品中凝血酶浓度的提高,采集的sers信号逐渐升高(i1612/i520),两者关系符合y=0.65+1.70x,表明在这一区间可以进行有效的定量分析。
实施例2
为了说明本发明的特异性,分别制备了小鼠igg抗体标准液,牛血清蛋白bsa,溶解酶素lysozyme(简称lyso)标准液和血红蛋白hemoglobin(简称hb)标准液,具体实施步骤参照实施例1;得到的信号强度可参照图5,说明本发明具有很强的特异性。
所用的小鼠igg抗体标准液和牛血清蛋白bsa购买于生工生物工程(上海)股份有限公司,溶解酶素lysozyme标准液和血红蛋白hemoglobin标准液购买于上海翊圣生物科技有限公司。
实施例3
为了检验此传感器在实际样品中的应用效果,我们将凝血酶添加到人血清样品中来作为真实样品的模拟。在此之前,需要对血清进行一系列的处理(过滤、离心、稀释)以消除基质效应对实验结果可能产生的影响。随后,在处理好的血清中,分别加入不同浓度的凝血酶。这些样品被分别用于检测和分析,具体实施步骤参照实施例1;所得到的结果如表1所示,这些结果表明,该方法能够很好的用于血清中凝血酶的检测。
表1利用本发明的纳米传感器体系测定模拟血清中凝血酶的结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华南师范大学
<120>一种利用竞争型的纳米传感器超灵敏检测凝血酶的方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>36
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>凝血酶适配体tba序列
<220>
<221>modified_base
<222>(36)..(36)
<223>-(ch2)7-nh2修饰
<400>1
tgtcagtggggttggacgggatggtgcctgactctc36
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>适配体aptamer-1序列
<220>
<221>modified_base
<222>(22)..(22)
<223>-(ch2)6-sh修饰
<400>2
ggcaccatcccgtccaacccca22