本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及健脾益肺方中毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的含量测定方法。
背景技术
慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease，copd)是一种具有气流阻塞特征的肺部疾病，与慢性支气管炎和(或)肺气肿密切相关，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。慢性阻塞性肺病是一个危害健康的全球性疾病，是我国城乡居民死亡的第三病因，并且给社会带来了巨大的经济负担。基于此，发明人所在的课题组研究出了健脾益肺方用于治疗慢性阻塞性肺病。所述健脾益肺方的重量份原料配比如下：柴胡10～20份，黄芪40～60份，熟党参40～60份，白术20～30份，燀桃仁10～20份，锁阳20～30份，广升麻10～20份，黄荆子20～30份。最优选配方为柴胡16份，黄芪50份，熟党参50份，白术25份，燀桃仁16份，锁阳25份，广升麻16份，黄荆子25份。
但是，健脾益肺方成分复杂，如大规模应用亟需建立内在的质量评估方法，以保证方子效果的稳定可靠。经本课题组研究发现，毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷为健脾益肺方中的2个主要成分，因此，建立健脾益肺方中毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷含量测定方法有利于控制健脾益肺方的质量。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种健脾益肺方中毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的含量测定方法。
本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：
健脾益肺方中毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的含量测定方法，其采用液相色谱法进行测定，具体包含如下步骤：
供试品溶液制备步骤；
色谱条件确定步骤；
供试品溶液测定以及毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷含量计算步骤；
所述的色谱条件为：色谱柱选用c18色谱柱；检测波长为250～280nm；流速为0.8～1.5ml/min；进样体积为10～20μl；以含0.05～0.2体积％磷酸的水为流动性a，乙腈为流动性b，采用梯度洗脱；
梯度洗脱包含如下几个洗脱阶段：0～6min，流动性b的体积分数变化为10％～20％；6～17min，流动性b的体积分数变化为20％～20.4％；17～35min，流动性b的体积分数变化为20.4％～40％；35～40min，流动性b的体积分数变化为40％～60％；40～45min，流动性b的体积分数变化为60％～85％。
优选地，色谱柱选用型号为5μm(4.6mm×250mm)的c18色谱柱；检测波长为260nm；流速为1ml/min；进样体积为15μl；以含0.1体积％磷酸的水为流动性a，乙腈为流动性b。
优选地，所述的供试品溶液制备步骤的具体方法包含如下步骤：
(1)按如下重量份称取中药原料，得健脾益肺方：柴胡10～20份，黄芪40～60份，熟党参40～60份，白术20～30份，燀桃仁10～20份，锁阳20～30份，广升麻10～20份，黄荆子20～30份；
(2)将健脾益肺方加水提取1～3次，将提取液合并、浓缩后得浓缩液；每次提取时间为1～3h，每次提取水的用量与健脾益肺方的用量比为6～12ml:1g；浓缩后浓缩液的体积与健脾益肺方的质量比为：1～2ml:1g；
(3)精密移取步骤(2)所述的浓缩液4～6ml至容量瓶定容至10ml，静置、离心后将上清液减压浓缩至干，再加入1.5～2.5ml甲醇复溶，过滤即得所述的供试品溶液。
进一步优选地，步骤(1)中按如下重量份称取中药原料，得健脾益肺方：柴胡16份，黄芪50份，熟党参50份，白术25份，燀桃仁16份，锁阳25份，广升麻16份，黄荆子25份。
进一步优选地，步骤(2)中将健脾益肺方加水提取2次，将提取液合并、浓缩后得浓缩液；每次提取时间为2h，每次提取水的用量与健脾益肺方的用量比为10ml:1g；浓缩后浓缩液的体积与健脾益肺方的质量比为：1～1.5ml:1g。
进一步优选地，步骤(3)中精密移取步骤(2)所述的浓缩液5ml至容量瓶定容至10ml，静置、离心后将上清液减压浓缩至干，再加入2ml甲醇复溶，过滤即得所述的供试品溶液。
进一步优选地，步骤(2)中所述的加水提取具体方法为加水后进行煎煮提取。
优选地，供试品溶液测定以及毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷含量计算步骤的具体方法包含如下步骤：
(1)按确定的色谱条件设定液相色谱仪参数；
(2)吸取供试品溶液，注入液相色谱仪中进行测定；
(3)根据在色谱图中确定毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的色谱峰，分别计算毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷色谱峰的峰面积，根据线性回归方程换算出毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的含量。
进一步优选地，步骤(3)中通过将毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的对照品溶液注入液相色谱仪中，根据保留时间确定毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的色谱峰。
优选地，毛蕊异黄酮苷的线性回归方程为：y＝3.7311×104x﹢18.485，r2＝0.9999；其中y代表峰面积，x代表毛蕊异黄酮苷的浓度，单位为mg/ml；
毛蕊异黄酮的线性回归方程为：y＝5.9932×104x﹢35.543，r2＝1；其中y代表峰面积，x代表毛蕊异黄酮苷的浓度，单位为mg/ml。
所述对照品溶液的制备的制备方法为：取毛蕊异黄酮对照品8.25mg，毛蕊异黄酮苷对照品5.50mg，精密称定，加甲醇制成每1ml含330μg和220μg的溶液，即得毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的对照品溶液。
有益效果：本发明首次建立了健脾益肺方中毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的含量测定方法，该方法准确可靠、稳定性及重复性好、检出限低；利用该方法有利于控制健脾益肺方的质量。
附图说明
图1为供试品溶液色谱图。
图2为对照品毛蕊异黄酮苷及毛蕊异黄酮色谱图。
图3为毛蕊异黄酮苷浓度-峰面积标准曲线图。
图4为毛蕊异黄酮浓度-峰面积标准曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。其中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的含量测定
1、供试品溶液制备：
(1)按如下重量称取中药原料，得健脾益肺方：柴胡16g，黄芪50g，熟党参50g，白术25g，燀桃仁16g，锁阳25g，广升麻16g，黄荆子25g；
(2)将健脾益肺方每次加10倍用量(质量体积比)的水煎煮提取2次，每次煎煮2h，将提取液合并、浓缩至200ml后得浓缩液；
(3)精密移取步骤(2)所述的浓缩液至容量瓶定容5ml至10ml，静置5min，离心5min(4000r/min)、离心后将上清液减压浓缩至干，再加入2ml甲醇复溶，然后用0.45μm微孔滤膜过滤即得所述的供试品溶液。
表1各个药材批号及生产厂家
来源：黄荆子由江西江中中药饮片厂生产提供，其他饮片均为康美药业生产，购置广东省中医院药房。
2、色谱条件确定步骤；
采用安捷伦1200高效液相色谱仪，色谱条件为：
色谱柱选用inertsil色谱柱型号为5μm(4.6mm×250mm)的c18色谱柱；检测波长为260nm；流速为1ml/min；进样体积为15μl；以含0.1体积％磷酸的水为流动性a，乙腈为流动性b采用梯度洗脱；梯度洗脱条件参见表2。
表2流动相梯度
3、供试品溶液测定以及毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷含量计算步骤；
首先按上述确定的色谱条件设定液相色谱仪参数；然后吸取供试品溶液，注入液相色谱仪中进行测定得供试品溶液色谱图(见图1)；再根据在色谱图中确定毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的色谱峰，在供试品溶液色谱图中分别计算毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷色谱峰的峰面积，根据线性回归方程换算出毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的含量；所述毛蕊异黄酮苷的线性回归方程为：y＝3.7311×104x﹢18.485，r2＝0.9999；其中y代表峰面积，x代表毛蕊异黄酮苷的浓度，单位为mg/ml；毛蕊异黄酮的线性回归方程为：y＝5.9932×104x﹢35.543，r2＝1；其中y代表峰面积，x代表毛蕊异黄酮苷的浓度，单位为mg/ml。
具体地，通过将毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的对照品溶液注入液相色谱仪中，根据保留时间确定毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的色谱峰(见图2)。所述对照品溶液的制备方法为：取毛蕊异黄酮对照品8.25mg，毛蕊异黄酮苷对照品5.50mg，精密称定，加甲醇制成每1ml含330μg和220μg的溶液，即得毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的对照品溶液。
从对照品溶液的毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的色谱峰(图2)可以看出，毛蕊异黄酮苷和毛蕊异黄酮的保留时间分别约为15.640min，34.310min。从供试品溶液色谱图(见图1)中可以看出，毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮的分离度良好。
上述毛蕊异黄酮苷的线性回归方程和毛蕊异黄酮的线性回归方程的获得方法如下：分别精密吸取毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4ml溶液定容至10ml容量瓶，取不同浓度混标溶液15μl注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品浓度为横坐标，对照品的峰面积为纵坐标绘制标准曲线(见图3和图4)，求出回归方程。
图3为毛蕊异黄酮苷浓度-峰面积标准曲线，结果表明毛蕊异黄酮苷在3.3～330μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。
图4为毛蕊异黄酮浓度-峰面积标准曲线，结果表明毛蕊异黄酮苷在2.2～220μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。
采用该方法结果测得供试品溶液中毛蕊异黄酮的峰面积为272.6，根据线性回归方程经换算后得供试品溶液中毛蕊异黄酮的含量为：3.95μg/ml。在用于健脾益肺方的质量控制过程中，若检测到供试品溶液中毛蕊异黄酮的含量明显低于3.95μg/ml，则说明健脾益肺方质量不合格。
采用该方法结果测得供试品溶液中毛蕊异黄酮苷的峰面积为321.1根据线性回归方程经换算后得供试品溶液中毛蕊异黄酮苷的含量为：8.11μg/ml。在用于健脾益肺方的质量控制过程中，若检测到供试品溶液中毛蕊异黄酮苷的含量明显低于8.11μg/ml，则说明健脾益肺方质量不合格。
实施例2方法学考察
中间精密度
精密吸取同一供试品溶液(参照实施例1方法制备得到)15μl，按实施例1所述的色谱条件，由2个分析人员分别于不同高效色谱仪在同一实验室分别测定，重复进样6次，测定毛蕊异黄酮及毛蕊异黄酮苷的峰面积，计算其rsd值，结果见表3，据峰面积求得rsd值为1.16％和1.10％，表明仪器精密度良好。
表3毛蕊异黄酮及其苷精密度峰面积
稳定性试验
取同一供试品溶液(参照实施例1方法制备得到)15μl，按实施例1所述的色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24h精密吸取15μl注入液相色谱仪测定。结果见表4，结果显示毛蕊异黄酮，毛蕊异黄酮苷峰面积的rsd分别为1.16％和0.09％，表明供试品溶液在24h内稳定。
表4毛蕊异黄酮及其苷稳定性峰面积
重复性试验
取同一批健脾益肺方药材粉末，共6份，按实施例1方法制备供试品溶液，按实施例1所述的色谱条件进行测定。结果见表5，结果显示毛蕊异黄酮苷，毛蕊异黄酮峰面积的rsd值分别为0.68％和1.26％，这说明方法重复性好。
表5毛蕊异黄酮及其苷重复性峰面积
加样回收率试验
精密称定健脾益肺方药材粉末，共9份。分别精密加入对照品溶液为样品含量的80％，100％，120％各三份，按实施例1方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算毛蕊异黄酮及毛蕊异黄酮苷的回收率和rsd值，结果见表6和表7。结果显示毛蕊异黄酮苷的平均回收率及rsd值为99.75％和1.73％；毛蕊异黄酮的平均回收率及rsd值为100.49％和1.94％，说明该方法准确可靠。
表6毛蕊异黄酮苷加样回收率试验结果
表7毛蕊异黄酮加样回收率试验结果
最低检测限(lod)和最低定量限(ldq)
在同样条件下260nm波长下，以同样的梯度洗脱，测定一组空白样品的背景信号，计算标准差s，分别以信噪比3:1(3倍s)、10:1(10倍s)确定lod和loq，求出“两限”，结果见表8，结果显示该方法毛蕊异黄酮及其苷的检出限低。
表8lod与ldq结果