钛表面纳米管仿生矿化方法及用于该方法的试剂盒与溶液与流程

本发明涉及钛表面纳米管仿生矿化技术领域，具体而言，涉及一种钛表面纳米管仿生矿化方法及用于该方法的试剂盒与溶液。

背景技术

钛金属凭借其优良的生物相容性和耐腐蚀性、优异的综合力学性能和工艺性能在牙种植体、人工关节、脊柱矫形内固定系统、髓内钉、矫形钢板等方面的应用中占据了主导地位，成为人体硬组织替代物和修复物的首选材料。

对钛金属表面进行改性是增强钛金属本身的细胞响应性、获得良好骨整合、提高种植体骨整合形成质量和速度的重要手段。通过模拟自然骨的纳米复合形貌、结构以及成分等特性进行钛种植体表面改性是目前该领域的重要研究热点。

tio2纳米管是一种较为简便、成熟的钛表面纳米改性方法，所获得的表面纳米管层具有同细胞外基质一样的纳米尺度，与骨组织相似的弹性模量，已证实具有良好的生物相容性。而在钛表面制备生物活性涂层如羟基磷灰石涂层、钙磷矿化物涂层等是钛表面改性的另一个有效方法。

现有的仿生沉积法制备钙磷涂层的技术是通过基底材料浸泡在仿生溶液即模拟体液中，在其表面沉积形成含有钙磷晶体的涂层。通常钛基底需经过碱热或酸碱合并处理，或者预组装官能团，然后再进行仿生沉积。与传统方法如高温烧结、等离子喷涂或激光融覆法等获得的钙磷矿化涂层相比，该技术在低温下模拟磷灰石形成的自然过程，是一种软复合过程，不存在热应力；形成的晶体为类骨磷灰石，与天然骨成分和结构相近，是具有广阔前景的技术，但是存在涂层形成过程不可控的问题，过多的钙磷矿化物覆盖了纳米管层，无法保持纳米管表面既有的纳米形貌。

技术实现要素：

本发明提供了一种氧化钛纳米管仿生矿化方法及用于该方法的试剂盒与溶液。

所述方法能在钛表面纳米管仿生矿化的过程中通过特定物质的介导，使钙磷矿化物均匀分布在纳米管管壁，保留纳米管的类骨纳米形貌，将纳米形貌和生物活性涂层有机结合，将更有利于促进骨整合。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种用于钛表面纳米管仿生矿化的试剂盒，包括：碱性磷酸酶、碱性磷酸酶的底物以及可溶性钙盐。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于钛表面纳米管仿生矿化的溶液，其含有如上所述试剂盒中的试剂。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种钛表面纳米管仿生矿化方法，包括：使用如上所述的溶液与钛表面纳米管接触反应。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、创新性地将酶介导仿生矿化法引入到钛表面纳米管领域(此前酶介导仿生矿化基本只应用于胶原支架等有机模板，几乎没有利用无机模板如金属等进行此矿化)；

2、创新性地实现纳米管形貌与钙磷涂层的有机结合，即在纳米管表面复合生物活性钙磷涂层同时还保留纳米管的纳米级别形貌。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的原理示意图；图1为钛表面纳米管(tnt)纵截面示意图，后浸泡在含有碱性磷酸酶(例如alp)、碱性磷酸酶底物(例如β-gp)、钙离子的矿化溶液中，最终在管壁及管周形成钙磷矿化物涂层，同时不覆盖纳米管的形貌；

图2为本发明一个实施例中钛表面tio2纳米管电镜形貌；

图3为本发明一个实施例中纯钛表面仿生沉积钙磷涂层表面形貌；

图4为本发明一个实施例中碱性磷酸酶介导钛表面tio2纳米管仿生矿化。

具体实施方式

本发明通过碱性磷酸酶可以有效控制钙磷涂层在tio2纳米管上的形成过程。碱性磷酸酶能够吸附在纳米管上并特异性水解其周围的底物，使溶液中钙磷离子过饱和，钙磷离子逐渐附着沉积到纳米管管壁，在保留纳米管原有的纳米级形貌基础上制备出致密均匀的钙磷矿化物涂层。

此法兼具纳米形貌和生物活性钙磷矿化物的表面将会进一步提高钛种植体的生物活性。

具体的，本发明涉及一种用于钛表面纳米管仿生矿化的试剂盒，包括：碱性磷酸酶、碱性磷酸酶的底物以及可溶性钙盐。

优选的，如上所述的试剂盒，所述碱性磷酸酶的底物为有机磷酸酯，更优选为磷酸单酯类化合物。

优选的，如上所述的试剂盒，所述磷酸单酯类化合物为β-甘油磷酸盐和/或α-萘酚磷酸盐；

优选为β-甘油磷酸钠和/或α-萘酚磷酸钠。

优选的，如上所述的试剂盒，所述可溶性钙盐选自cacl2和/或ca(no3)2。

上述可溶性钙盐可带结晶水。

优选的，如上所述的试剂盒，所述碱性磷酸酶可来源于细菌或动物；

更优选为节肢动物或哺乳动物；

更优选为牛或人。

碱性磷酸酶的器官来源可以为肠道、胚胎或者不具有组织特异性(肝、骨骼、肾等)。

优选的，如上所述的试剂盒，所述碱性磷酸酶为bacterialalkalinephosphatase(bap)、shrimpalkalinephosphatase(sap)、calfintestinalalkalinephosphatase(cip)、placentalalkalinephosphatase(palp)以及thesecretedalkalinephosphatase(seap)中的一种或多种。

上述磷酸酶为实验室中常见的磷酸酶。

在研究中最常用的alp如下：

细菌碱性磷酸酶bacterialalkalinephosphatase(bap)，来源：escherichiacolic4；

shrimpalkalinephosphatase(sap)，来源：一种北极虾(pandalusborealis)；

小牛肠碱性磷酸酶calfintestinalalkalinephosphatase(cip)；

胎盘碱性磷酸酶placentalalkalinephosphatase(palp)和分泌性碱性磷酸酶thesecretedalkalinephosphatase(seap)，后者是前者的c末端短缺版——与palp相比，seap没有palp的c末端最后24个氨基酸(这24个氨基酸构成了与糖基化磷脂酰肌醇靶向锚定的区域)。

优选的，如上所述的试剂盒，所述碱性磷酸酶以牛血清的形式包装于所述试剂盒中。

优选的，如上所述的试剂盒，所述组合产品还包括ph调节剂、缓冲盐/试剂、模拟体液、细胞培养基以及水中的一种或多种。

所述缓冲试剂一般为不含磷酸根、碳酸根等能与ca²⁺形成沉淀的阴离子，且缓冲范围为中性或碱性范围。

在一些实施方式中，所述缓冲试剂为tris-buffer缓冲液。

所述缓冲盐用于配制所述缓冲试剂。

在一些实施方式中，所述ph调节剂为naoh。

在一些实施方式中，所述细胞培养基为mem培养基。

在一些实施方式中，所述模拟体液为sbf(simulatedbodyfluid)。

所述试剂盒中的各试剂一般单独包装，(若不发生会使得试剂变质的化学反应的话)也可以混合包装。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于钛表面纳米管仿生矿化的溶液，其含有如上所述试剂盒中的试剂。

所述溶液由所述试剂盒配制得到，一般即配即用。

优选的，如上所述的溶液，所述溶液的ph＝6.0～11.5；还可以选择7.0、8.0、9.0、10.0或11.0；

ph的选择以磷酸钙不溶或微溶，且碱性磷酸酶不变性失活为准。

根据本领域技术人员所公知，部分碱性磷酸酶，例如胎盘来源的碱性磷酸酶，可在ph＝11.5仍具有可接受的酶活性。

优选的，所述溶液中所述碱性磷酸酶的底物经所述碱性磷酸酶催化释放的磷酸根与所述可溶性钙盐溶解释放的ca²⁺的摩尔比为(0.5～3.5)：(1～5)；更优选为2:3，也可以选择(1～3)：(2～3)。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种钛表面纳米管仿生矿化方法，包括：使用如上所述的溶液与钛表面纳米管接触反应；

优选的，所述反应的条件为：

35℃～39℃孵育5d～9d；每2d～3d换一次液；

也可以选择36℃～38℃孵育6d～8d；每2d～3d换一次液。

除非另有限定，本发明使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本发明所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。

为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。

本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了一种用于钛表面纳米管仿生矿化的溶液的配制方法：

α-mem(细胞培养液)+10％fbs(胎牛血清)+2.2mg/mlβ-gp(β-甘油磷酸钠)+3mg/mlcacl2·2h2o。

实施例2

本实施例提供了一种用于钛表面纳米管仿生矿化的溶液的配制方法：

sbf模拟体液+碱性磷酸酶palp(14.8u/ml)+5mg/mlα-萘酚磷酸钠+3mg/mlca(no3)2，tris-buffer(ph＝8.6)。

实施例3

本实施例提供了一种用于钛表面纳米管仿生矿化的溶液的配制方法：

模拟体液+碱性磷酸酶bap(40u/ml)+4mg/mlβ-gp(β-甘油磷酸钠)+6mg/mlcacl2·2h2o，tris-buffer(ph＝9.6)。

实施例4

本实施例提供了一种用于钛表面纳米管仿生矿化的溶液的配制方法：

水+碱性磷酸酶sap(80u/ml)+4mg/mlα-萘酚磷酸钠+4mg/mlca(no3)2，tris-buffer(ph＝8.0)。

实施例5

本实施例提供了一种用于钛表面纳米管仿生矿化的溶液的配制方法：

水+碱性磷酸酶palp(70u/ml)+2mg/mlβ-gp(β-甘油磷酸钠)+6mg/mlcacl2，tris-buffer(ph＝11.5)。

实施例6～10

实施例6～10提供了一种钛表面纳米管仿生矿化方法，分别使用实施例1～5制备得到的溶液与钛表面纳米管共孵育，36℃～38℃孵育7d；每2d～3d换一次液。

其中，实施例6对钛表面纳米管进行处理前后的电镜照片分别如图2-4所示。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。