透析袋拟合厌氧氨氧化菌胞外聚合物吸附底物测定方法与流程

本发明涉及一种胞外聚合物吸附底物测定方法，特别是一种透析袋拟合厌氧氨氧化菌胞外聚合物吸附底物测定方法。

背景技术：

eps作为微生物代谢生长过程中分泌或者捕获的蛋白质、多糖等混合聚合物，对细菌生长有重要作用，厌氧氨氧化菌尤为如此，所述的eps为胞外聚合物，英文表述为extracellularpolymericsubstances，简写为eps。因为厌氧氨氧化菌成粒作用与颗粒的稳定不仅依靠一定浓度底物保证细菌生长，而且依靠eps维持细菌颗粒化。目前研究者已经认识到eps是厌氧氨氧化菌分泌的，并且过量eps对厌氧氨氧化菌的增长有不利影响。但是，eps作为厌氧氨氧化菌生长所分泌到外部环境中的物质，对厌氧氨氧化菌的生长具体有什么样的影响，eps与厌氧氨氧化菌生长所必须的底物：氨氮与亚硝态氮之间以什么样的方式结合，乃至传质尚不清楚。适合厌氧氨氧化菌eps的提取方法有很多，但是如何检测eps对底物的吸附，目前没有简单有效的方法。eps对底物吸附的检测目前还没有统一的办法。傅里叶红外光谱(ftir)等通过检测键能的改变只能检测数次eps对底物的吸附实验。

技术实现要素：

本发明的目的是要提供一种透析袋拟合厌氧氨氧化菌胞外聚合物吸附底物测定方法，解决利用化学方法检测eps对氨氮或亚硝态氮吸附量的问题。

本发明的目的是这样实现的：本发明的测定方法是利用透析袋透析已经吸附底物的eps混合液，测定外部透析液底物的浓度，确定eps的吸附量；

具体步骤为：

步骤1、透析袋经过预处理后，用无氧无氨水清洗两次，用夹子将透析袋一侧夹住防止漏水，向透析袋中加入底物溶液和加重物，上端用同样的夹子夹住防止漏水，透析袋外部环境为与透析袋内部等体积的无氧无氨水溶液，所述的底物溶液为氨氮溶液或者亚硝态氮溶液，所述氨氮溶液的浓度为10-200mgn/l，所述亚硝态氮溶液的浓度为12-264mgn/l；所加入的加重物为透析袋的配重，载有底物溶液和加重物的透析袋悬浮或完全浸没在外部无氧无氨水的环境中，置于20℃-35℃温度条件进行透析，隔1h测定透析袋外部溶液中氨氮溶液或者亚硝态氮溶液的浓度，并用origin8.0拟合透析曲线；

步骤2、用相同浓度的氨氮溶液或亚硝态氮溶液为底物溶液，加入已知浓度的eps溶液使总体积与第一步骤透析的底物溶液浓度和体积相同，夹子、加重物、外部环境与透析条件均与步骤1相同，隔2h测定透析袋外部溶液中的氨氮或者亚硝态氮，利用步骤1的拟合透析曲线，拟合最终外部透析液的氨氮溶液或亚硝态氮溶液底物的浓度；则eps对氨氮溶液或亚硝态氮溶液的吸附量为第一次拟合透析曲线的拟合最终外部透析浓度与加入eps溶液后拟合透析曲线的拟合最终外部透析浓度之差；

其中，n底物中氨氮溶液或者亚硝态氮溶液的含量，与neps中该物质的含量相等；k底物keps为拟合透析曲线的k值；t为透析时间h；e为自然常数。

所述的已知浓度的eps溶液是利用超声法提取的eps溶液，经过冷冻干燥器处理，将eps粉末于-20℃保存，每次称取10mg，配置到100ml去离子水中，冷藏保存待用。

所述的加重物预处理：选取玻璃珠，用没过玻璃珠的无水乙醇浸泡10min，弃去浸泡过玻璃珠的无水乙醇废液，再加入没过玻璃珠的无水乙醇浸泡10min，弃去废液，用去离子水冲洗干净，并用去离子水再浸泡10min，操作两次；后将玻璃珠置于105℃烘箱烘干，密封保存，备用。

所述的加重物为玻璃珠或陶瓷片，所述的玻璃珠或陶瓷片要求表面光滑，玻璃珠没有粒径要求。

所述的透析袋预处理：将透析袋剪成15-20cm长，用大体积的2％(w/v)碳酸氢钠和ph＝8的1mmol/l乙二胺四乙酸二钠溶液将透析袋煮沸10min，用去离子水彻底洗净透析袋，后用上述乙二胺四乙酸二钠溶液再将透析袋煮沸10min，此时不可用手触碰透析袋；冷却后，将透析袋完全浸入去离子水中，密封4℃保存；使用之前将透析袋用去离子水洗干净，将内部装满水后排出，使用时留下1/3至1/2的空间，袋内加入预处理过的玻璃珠，使之悬浮于透析液内，所述的透析液为无氧无氨水。

所述的无氧无氨水：取去离子水，用高纯氮气曝气15min，后密封保存，备用。

所述的拟合透析曲线：拟合透析曲线假设透析袋内氨氮溶液或者亚硝态氮溶液底物初始含量为no，并且溶质伴随水穿过透析袋；根据物质守恒定律，任意时间内，透析袋内与透析袋外氨氮或者亚硝态氮量之和等于最初加入透析袋内的氨氮或者亚硝态氮的量，即为no，透析无限长时间后，透析袋内外物质量均为1/2no，透析袋内外溶液体积为(透析袋内体积+透析袋外体积)/2。

拟合透析曲线的数学计算方法如下：

(a)当透析袋内外水溶液体积不同时，膜内初始体积为v，初始底物量为no，外部初始体积nv，初始底物量为0；

dn/dt是物质透过膜的速率，某时刻透析袋袋内浓度与袋外浓度差值与物质透过膜速率关系：

积分后得到：

整理：

(b)当透析袋内外溶液体积相等时；根据拟合透析曲线的必要条件2：任意时刻由透析袋内向外透析的溶液体积与由透析袋外向内透析的溶液体积相等，此条件下，透析速率可以用膜内外底物的量表示，所以该拟合透析曲线可以简化为：

整理得到：

根据透析时间、透析袋内部底物初始浓度、检测得到的透析袋外部底物浓度，利用origin8.0拟合计算在20℃-35℃条件下的k值。

拟合透析曲线的必要条件如下：

(1)：20℃-35℃温度条件下，透析速率只与透析袋内外待透析物浓度差有关，透析速率常数为k；

(2)：物质由内透析进入外部溶液后，则与外部溶液混合均匀；

(3)：水分子可以自由透过透析袋，20℃-35℃温度条件下，水分子透过透析袋的速率只与透析袋本身性质有关；

(4)：任意时刻由透析袋内向外透析的溶液体积与由透析袋外向内透析的溶液体积相等。

eps溶液的提取方法，具体步骤如下：

步骤1、取得污泥后，将污泥置于离心管内，于3000rpm/min离心10min，弃去上清液；

步骤2、加入没过污泥体积的磷酸缓冲溶液，置于30度2h，然后于3000rpm/min离心10min，弃去上清液；

步骤3、此时认为底物基质已经去除；

步骤4、然后取25-50ml体积的污泥，加入与污泥体积一样的无氧无氨水，密封置于超声发生器里；超声条件为频率为40khz，温度为30℃，时间为30min；eps经过超声提取后，9000rpm/min离心10min，用针管抽出上清液，并0.45um滤膜过滤；

步骤5、将过滤好的eps置于透析袋中，封口置于去离子水中透析，3h后更换一次去离子水，隔夜前再更换一次去离子水；

步骤6、测透析袋内物质的蛋白、多糖浓度；

步骤7、将其他eps置于冰箱里冷冻，后用冷冻干燥器冷冻干燥，获得eps粉末，于-20℃温度条件保存；

步骤8、每次称取10mg，配置到100ml去离子水中，冷藏保存，以此溶液进行eps吸附。

有益效果和优点，由于采用了上述方案，利用实验室现有条件，利用化学检测方法与数学计算，进行eps对氨氮或者亚硝态氮底物吸附的检测，实验花费很少；利用蛋白截留分子量3500的透析袋，对吸附了氨氮或亚硝态氮达到饱和的eps-氨氮或亚硝态氮混合液进行透析，测定透析袋外部中氨氮或亚硝态氮的浓度，来计算eps吸附的氨氮或亚硝态氮的量。本发明操作简单，相对低成本的对eps吸附氨氮或亚硝态氮的检测。

解决了利用化学方法检测eps对氨氮或亚硝态氮吸附量的问题，达到了本发明的目的。

附图说明

图1是本发明的结构图。

图中，1、烧杯，2、无氧无氨水，3、夹子，4、透析袋，5、玻璃珠，6、转子，7、磁力搅拌器。

具体实施方式

本发明的测定方法是利用透析袋透析已经吸附底物的eps混合液，测定外部透析液底物的浓度，确定eps的吸附量。

具体步骤为：

步骤1、透析袋经过预处理后，用无氧无氨水清洗两次，用夹子将透析袋一侧夹住防止漏水，向透析袋中加入底物溶液和加重物，上端用同样的夹子夹住防止漏水，透析袋外部环境为与透析袋内部等体积的无氧无氨水溶液，所述的底物溶液为氨氮溶液或者亚硝态氮溶液，所述氨氮溶液的浓度为10-200mgn/l，所述亚硝态氮溶液的浓度为12-264mgn/l；所加入的加重物为透析袋的配重，载有底物溶液和加重物的透析袋悬浮或完全浸没在外部无氧无氨水的环境中，置于20℃-35℃温度条件进行透析，隔1h测定透析袋外部溶液中氨氮溶液或者亚硝态氮溶液的浓度，并用origin8.0拟合透析曲线；

步骤2、用相同浓度的氨氮溶液或亚硝态氮溶液为底物溶液，加入已知浓度的eps溶液使总体积与第一步骤透析的底物溶液浓度和体积相同，夹子、加重物、外部环境与透析条件均与步骤1相同，隔2h测定透析袋外部溶液中的氨氮或者亚硝态氮，利用步骤1的拟合透析曲线，拟合最终外部透析液的氨氮溶液或亚硝态氮溶液底物的浓度；则eps对氨氮溶液或亚硝态氮溶液的吸附量为第一次拟合透析曲线的拟合最终外部透析浓度与加入eps溶液后拟合透析曲线的拟合最终外部透析浓度之差；

其中，n底物中氨氮溶液或者亚硝态氮溶液的含量，与neps中该物质的含量相等；k底物keps为拟合透析曲线的k值；t为透析时间h；e为自然常数；

所述的已知浓度的eps溶液是利用超声法提取的eps溶液，经过冷冻干燥器处理，将eps粉末于-20℃保存，每次称取10mg，配置到100ml去离子水中，冷藏保存待用。

所述的加重物预处理：选取玻璃珠，用没过玻璃珠的无水乙醇浸泡10min，弃去浸泡过玻璃珠的无水乙醇废液，再加入没过玻璃珠的无水乙醇浸泡10min，弃去废液，用去离子水冲洗干净，并用去离子水再浸泡10min，操作两次；后将玻璃珠置于105℃烘箱烘干，密封保存，备用。

所述的加重物为玻璃珠或陶瓷片，所述的玻璃珠或陶瓷片要求表面光滑，玻璃珠没有粒径要求。

所述的透析袋预处理：将透析袋剪成15-20cm长，用大体积的2％(w/v)碳酸氢钠和ph＝8的1mmol/l乙二胺四乙酸二钠溶液将透析袋煮沸10min，用去离子水彻底洗净透析袋，后用上述乙二胺四乙酸二钠溶液再将透析袋煮沸10min，此时不可用手触碰透析袋；冷却后，将透析袋完全浸入去离子水中，密封4℃保存；使用之前将透析袋用去离子水洗干净，将内部装满水后排出，使用时留下1/3至1/2的空间，袋内加入预处理过的玻璃珠，使之悬浮于透析液内，所述的透析液为无氧无氨水。

所述的无氧无氨水：取去离子水，用高纯氮气曝气15min，后密封保存，备用。

所述的拟合透析曲线：拟合透析曲线假设透析袋内氨氮溶液或者亚硝态氮溶液底物初始含量为no，并且溶质伴随水穿过透析袋；根据物质守恒定律，任意时间内，透析袋内与透析袋外氨氮或者亚硝态氮量之和等于最初加入透析袋内的氨氮或者亚硝态氮的量，即为no，透析无限长时间后，透析袋内外物质量均为1/2no，透析袋内外溶液体积为(透析袋内体积+透析袋外体积)/2。

拟合透析曲线的数学计算方法如下：

(a)当透析袋内外水溶液体积不同时，膜内初始体积为v，初始底物量为no，外部初始体积nv，初始底物量为0；

dn/dt是物质透过膜的速率，某时刻透析袋袋内浓度与袋外浓度差值与物质透过膜速率关系：

积分后得到：

整理：

(b)当透析袋内外溶液体积相等时；根据拟合透析曲线的必要条件2：任意时刻由透析袋内向外透析的溶液体积与由透析袋外向内透析的溶液体积相等，此条件下，透析速率可以用膜内外底物的量表示，所以该拟合透析曲线可以简化为：

整理得到：

根据透析时间、透析袋内部底物初始浓度、检测得到的透析袋外部底物浓度，利用origin8.0拟合计算在20℃-35℃条件下的k值。

拟合透析曲线的必要条件如下：

(1)：20℃-35℃温度条件下，透析速率只与透析袋内外待透析物浓度差有关，透析速率常数为k；

(2)：物质由内透析进入外部溶液后，则与外部溶液混合均匀；

(3)：水分子可以自由透过透析袋，20℃-35℃温度条件下，水分子透过透析袋的速率只与透析袋本身性质有关；

(4)：任意时刻由透析袋内向外透析的溶液体积与由透析袋外向内透析的溶液体积相等。

eps溶液的提取方法，具体步骤如下：

步骤1、取得污泥后，将污泥置于离心管内，于3000rpm/min离心10min，弃去上清液；

步骤2、加入没过污泥体积的磷酸缓冲溶液，置于30度2h，然后于3000rpm/min离心10min，弃去上清液；

步骤3、此时认为底物基质已经去除；

步骤4、然后取25-50ml体积的污泥，加入与污泥体积一样的无氧无氨水，密封置于超声发生器里；超声条件为频率为40khz，温度为30℃，时间为30min；eps经过超声提取后，9000rpm/min离心10min，用针管抽出上清液，并0.45um滤膜过滤；

步骤5、将过滤好的eps置于透析袋中，封口置于去离子水中透析，3h后更换一次去离子水，隔夜前再更换一次去离子水；

步骤6、测透析袋内物质的蛋白、多糖浓度；

步骤7、将其他eps置于冰箱里冷冻，后用冷冻干燥器冷冻干燥，获得eps粉末，于-20℃温度条件保存；

步骤8、每次称取10mg，配置到100ml去离子水中，冷藏保存，以此溶液进行eps吸附。

实施例1：目前针对厌氧氨氧化菌eps提取方法主要有：edta法，超声法，离子交换法，离心法，加热法，搅拌法，以及两种或多种方法混合利用。一般而言，edta法、超声法、搅拌法、加热法操作比较简单，经过处理后，一般利用离心法获得含有eps的上清液，离子交换法需要添加阳离子交换树脂。各种方法提取得到的eps各物质含量不同，各有优劣势。本专利采用的方法为超声提取法。

取得污泥后，一定量污泥置于离心管内，于3000rpm/min离心10min，弃去上清液。加入没过污泥体积的磷酸缓冲溶液，置于30度2h，然后于3000rpm/min离心10min，弃去上清液。此时认为底物基质已经去除。后取一定体积的污泥，加入与污泥体积一样的无氧无氨水，密封置于超声发生器里。超声条件为40khz，30度，30min。eps经过超声提取后，9000rpm/min离心10min，用针管抽出上清液，并0.45um滤膜过滤。将过滤好的eps置于透析袋中，封口置于去离子水中透析，3h后更换一次去离子水，隔夜前再更换一次去离子水。测透析袋内物质的蛋白、多糖等浓度。将其他eps置于冰箱里冷冻，后用冷冻干燥器冷冻干燥，获得eps粉末，-20℃保存。每次称取一定量的eps用容量瓶配置一定浓度的eps溶液，以此溶液进行eps吸附。每次吸附，预先将底物溶液调节ph后，与eps溶液置于恒温装置恒温，再将eps溶液与底物溶液混合，进行吸附。