一种通肾颗粒的检测方法与流程

本发明属于中药检测领域，具体涉及一种通肾颗粒的检测方法。

背景技术：

随着养殖集约化的发展和药物超量长时间使用，畜禽的肾脏疾病发生率愈来愈高，损伤水平愈来愈重，已成为畜禽病中不可忽视的问题。肾脏疾病是由一种或多种致病因子引起的畜禽肾脏机能障碍与损伤的疾病的综合表现，临床上主要有急性肾炎、慢性肾炎、肾盂肾炎、肾结石、输尿管结石等。目前畜禽肾病的防治主要为用药治疗和加强饲养管理。用药方面主要使用消炎药、广谱抗生素和利尿药，但抗生素药物存在明显的缺点。大量的现代研究表明，很多中药都具有解热、抗炎、抑菌、利尿的功效，通肾颗粒是由黄芪、苦参、白茅根、金银花等药材制成的中兽药复方颗粒剂，具有补气固表、清热解毒的功效，主要用于急慢性肾炎、尿路感染等，该颗粒功效显著、安全无毒、稳定性好，治疗有效率及治愈率高，死亡率低。

黄芪和金银花均为通肾颗粒处方中的主要药材，黄芪具有补气升阳、固表止汗、敛疮排脓、消肿生肌的功效，研究表明黄芪甲苷是黄芪的主要有效成分，具有保护肾脏和利尿的作用。金银花性寒，味甘，主要成分为绿原酸，具有清热解毒、疏散风热的功效和解热、消炎、抗菌的作用。

兽药典中采用薄层色谱的方法对黄芪进行鉴别的过程中，采用中性氧化铝柱进行粗分后再采用正丁醇萃取，该过程需要上柱子，过程比较繁琐。绿原酸含量检测方法有多种，但由于许多物质和绿原酸分子结构相似，同存于一种药材或制剂中，因此在进行含量测定时常难以分离。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决上述现有技术存在的问题，提供一种通肾颗粒的检测方法，对黄芪的薄层色谱鉴别方法和绿原酸含量测定方法进行改进，以更好的控制通肾颗粒的质量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种通肾颗粒的检测方法，通肾颗粒由黄芪、苦参、白茅根和金银花为原材料制备而成，采用薄层色谱法对该中药制剂中的黄芪进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对该中药制剂中金银花中的绿原酸含量进行测定。

黄芪薄层色谱鉴别方法包括以下步骤：（1）供试品溶液的制备：取通肾颗粒研细后的粉末，加甲醇加热回流提取，滤过，滤液蒸干，残渣加水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取，合并正丁醇液，用水洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，加入中性氧化铝粉末，用40%甲醇分次搅拌洗涤，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，得供试品溶液；（2）对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的对照品溶液；（3）分别将对照品溶液和供试品溶液在薄层板上点样，展开剂展开，显色，检视，比对即可。

作为优选，黄芪薄层色谱鉴别方法包括以下步骤：（1）取通肾颗粒研细后的粉末4g，加甲醇20-30ml，加热回流1-2小时，滤过，滤液蒸干，提取后残渣用30-50ml蒸馏水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2-3次，每次20-30ml，合并正丁醇液，用水洗涤2-3次，每次20-30ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，加入中性氧化铝粉末2-4g，中性氧化铝粉末为100-200目，用40%甲醇分次搅拌洗涤，甲醇总用量为50ml，滤过，溶液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液；（2）取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；（3）分别取2μl供试品溶液和对照品溶液在高效硅胶g板上点样，以三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以显色剂10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，在紫外光灯365nm下观察，显相同的橙黄色荧光斑点。

作为优选，黄芪薄层色谱鉴别方法包括以下步骤：（1）取通肾颗粒研细后的粉末4g，加甲醇20ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，提取后残渣用30ml蒸馏水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2-3次，每次20-30ml，合并正丁醇液，用水洗涤2-3次，每次20-30ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，加入中性氧化铝粉末2g，中性氧化铝粉末为100-200目，用40%甲醇分次搅拌洗涤，甲醇总用量为50ml，滤过，溶液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液；（2）取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；（3）分别取2μl供试品溶液和对照品溶液在高效硅胶g板上点样，以三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以显色剂10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，在紫外光灯365nm下观察，显相同的橙黄色荧光斑点。

金银花中绿原酸含量的测定方法包括以下步骤：（1）供试品溶液的制备：取通肾颗粒研细后的粉末，以50%甲醇提取制备供试品溶液；（2）对照品溶液的制备：取绿原酸对照品，以50%甲醇为溶剂制备对照品溶液；（3）分别吸取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪中，以外标法计算通肾颗粒中绿原酸含量即可，其中，色谱条件如下：色谱柱为diamonsilc18，4.6×250mm，5μm；以乙腈-水-冰醋酸＝13∶87∶0.2为流动相；检测波长为327nm；流速1ml/min；柱温为25-30℃。

作为优选，金银花中绿原酸含量的测定方法包括以下步骤：（1）供试品溶液的配制方法：取通肾颗粒研细后的粉末2.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，超声功率为250w，频率为35khz，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置于25ml棕色容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液；（2）对照品溶液的配制方法：取绿原酸对照品适量，精密称定，置于棕色容量瓶中，加50%甲醇制成每1ml含40μg的溶液，摇匀，即得对照品溶液；（3）测定方法：分别吸取供试品溶液和对照品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪中，测定，计算，即得。

本发明的有益效果在于：本发明提供的黄芪薄层色谱鉴别方法避免了上柱子的过程，并且缩减了溶剂蒸干的时间，大大简化了供试品的处理过程，节省了样品处理时间，且所得薄层色谱斑点清晰，该方法灵敏、简便，可用于通肾颗粒中黄芪的质量控制；绿原酸含量测定方法改用乙腈-水-冰醋酸（13∶87∶0.2）为流动相，所得色谱图分离效果好，出峰时间短，测定结果准确可靠，精密度和稳定性良好，可作为通肾颗粒中绿原酸含量控制。

附图说明

图1为黄芪薄层色谱图，图中3是对照品溶液，1和4是样品溶液2，2和5是样品溶液1。

图2为对照品的高效液相色谱图。

图3为样品的高效液相色谱图。

图4为绿原酸浓度与峰面积线性关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

通肾颗粒中黄芪的鉴别

1.采用2015版兽药典黄芪薄层色谱鉴别方法制备供试品溶液

取通肾颗粒研细后的粉末4g，加甲醇20ml，加热回流1小时，滤过，滤液加于中性氧化铝柱（100-120目，5g，内径为10-15mm）上，用40%甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为样品溶液1。

2.采用本发明黄芪薄层色谱鉴别方法制备供试品溶液

取通肾颗粒研细后的粉末4g，加甲醇20ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，加入100目的中性氧化铝2g，用40%甲醇50ml分次搅拌洗涤，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为样品溶液2。

3.对照品溶液的制备

取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

4.薄层色谱实验

吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光灯（365nm）下观察，结果显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，见图1。

实施例2

绿原酸含量的测定

1.供试品溶液的制备

称通肾颗粒研细后的粉末2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率250w，频率35khz）30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.对照品溶液的制备

取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加50%甲醇制成每1ml含40μg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。

3.色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水-冰醋酸（13∶87∶0.2）为流动相；检测波长为327nm；流速1ml/min；进样量20μl；色谱分离柱温25℃。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000。按上述色谱条件进样，结果供试品溶液中绿原酸峰形好，出峰时间短，且灵敏度较高，能与基线很好的分离，见图2和图3。

4.线性关系考察

精密称取绿原酸标准品50mg，置于50ml棕色容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，混匀，得1mg/ml的绿原酸标准品溶液。分别精密吸取1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml、12.0ml，置于100ml棕色容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，得到不同浓度的绿原酸标准品溶液。按2.2.2中的色谱条件进样，以绿原酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制曲线，得到回归方程y=36977x+174830，r²=0.9991。结果表明，绿原酸在10-120ug范围内线性关系良好。结果见图4。

5.精密度考察

精密吸取供试品溶液20μl，连续进样6次，测定峰面积，结果绿原酸精密度良好，rsd值为1.5%。

6.稳定性考察

精密吸取供试品溶液20μl，分别于0，2，4，6，8，10，12h注入高效液相色谱仪测定，测得绿原酸峰面积的rsd值为1.5％，结果表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

7.加样回收率

精密称取已知绿原酸含量的样品，共6份，分别精密加入不同量的绿原酸对照品，按2.2.1方法制备供试品溶液，测定含量，计算回收率，结果绿原酸的平均回收率为99.6%，表明实验过程中偶然误差和人工误差较小，结果见表1。

表1加样回收率（n=6）

8.样品含量测定

取3批次通肾颗粒样品制备供试品溶液，测定其绿原酸含量，每批样品测定5个样，取平均值，结果见表2。

表2通肾颗粒中绿原酸的平均含量(%)

结论

通肾颗粒中黄芪的鉴别药典里采用中性氧化铝柱进行洗脱粗分后再采用正丁醇萃取，本发明先用正丁醇萃取后再用中性氧化铝粉末进行吸附，避免了上柱子的过程，并缩减了溶剂蒸干的时间，大大简化了供试品的处理过程，节省了样品处理时间且所得薄层色谱斑点清晰，该方法灵敏、简便，可用于通肾颗粒中黄芪的质量控制。

绿原酸含量检测方法有多种，但由于许多物质和绿原酸分子结构相似，同存于一种药材或制剂中，因此在进行含量测定时常难以分离。现在多采用高效液相色谱法来检测绿原酸的含量，但在流动相的选择上有所差别。2015版兽药典中金银花中绿原酸含量检测采用乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87）为流动相，本发明检测通肾颗粒中绿原酸含量采用乙腈-水-冰醋酸（13∶87∶0.2）为流动相，所得色谱图分离效果好，出峰时间短，测定结果准确可靠，精密度和稳定性良好，可作为通肾颗粒中绿原酸含量控制。

薄层色谱鉴别法和高效液相色谱法是中药质量控制的主要方法，单味药材的鉴别和含量检测方法在中药复方制剂中有时候效果并不好，这就需要对其进行改进。本发明使用的黄芪薄层鉴别方法和绿原酸含量检测方法操作简单、结果准确，可用于通肾颗粒的质量控制，给通肾颗粒质量标准的制定提供参考。

以上所述为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明整体构思的前提下，还可以做出若干变化和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。