一种饲料非淀粉多糖组分分析方法与流程

本发明涉及一种饲料非淀粉多糖组分分析方法，特别是涉及饲料样品总非淀粉多糖组分解离、不溶性非淀粉多糖组分解离和非淀粉多糖组分解析的方法。

背景技术：

2017年度我国大豆进口量9560多万吨，谷物1130多万吨，稳居全球第一大进口国，其中主要原因是畜禽生产消耗量越来越大。饲料资源短缺、人畜争粮矛盾日益加剧。因此，提高饲料原料利用率和合理开发非粮资源(如粮食加工副产物)将是保障我国畜牧业持续健康发展的重要出路。与谷物相比，加工副产物(糠麸、糟渣、饼粕等)含有较高的非淀粉多糖。非淀粉多糖包裹可消化养分，抵御内源消化酶的降解，形成屏蔽效应(anguitaetal.,2006)；同时非淀粉多糖具有重要的营养生理作用，部分经大肠发酵产生挥发性脂肪酸，提供能量。

饲料中非淀粉多糖分析法可作为揭示饲粮纤维对饲料养分营养价值的一个有力工具。然而，目前分析方法最大的挑战是可重复性低于范式纤维分析法(nrc，2012)。需要进一步改进低分子量不可消化碳水化合物纳入非淀粉多糖体系，并校正不可消化残渣的含量(gordonetal.,2007)。因此，准确解析饲料中非淀粉多糖组分的含量具有重要的意义。

目前，研究报道的饲料非淀粉多糖含量方法存在称样量、水解时间、试剂浓度等参数不统一，导致测试精度和重复性低，还未被实验室广泛使用(theander，1995；bachknudsen，1997；nrc，2012)。本发明通过大量的试验分析验证，克服了目前饲料非淀粉多糖分析方法的测试不稳定性和结果高变异性，通过可溶性非淀粉多糖组分和不溶性非淀粉多糖组分有效的解离和非淀粉多糖组分解析，达到了准确分析非淀粉多糖含量的目的。

技术实现要素：

本发明的技术解决问题：为了克服目前饲料中非淀粉多糖分析方法的测试不稳定性和结果高变异性的难题，提供一种饲料非淀粉多糖组分分析方法，通过规定适宜的称样量，可溶性非淀粉多糖组分和不溶性非淀粉多糖组分有效的解离和非淀粉多糖组分解析，准确获取饲料非淀粉多糖组分含量。

本发明技术解决方案：一种饲料非淀粉多糖组分分析方法，依次包括以下步骤：饲料样品准备、饲料样品前处理、总非淀粉多糖组分解离、不溶性非淀粉多糖组分解离、非淀粉多糖组分解析，其中：

(1)饲料样品准备：选取饲料放入粉碎机中，其中所述的饲料包括配合饲料和组成配合饲料的原料，将所述的粉碎机的转速控制在5000～6000r/min，粉碎时间为5～10min，将粉碎后的饲料过35目筛；置于-18～-22℃储存备用；

(2)饲料样品前处理：精确称取参比日粮纤维45～60mg和饲料0.15～0.30g至离心管中，加入20～30ml石油醚超声处理10～15min，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃上清并干燥。加入80％的乙醇超声处理，弃上清并干燥。加入10～15ml乙酸缓冲液(ph＝5.0)，并加入60～80μlα-淀粉酶，沸水浴。然后加入60～80μl淀粉葡糖苷酶50～60℃恒温震荡水浴10～12h。取出离心管冷却至室温，3000～5000r/min室温离心5～10min；

(3)总非淀粉多糖组分解离：在(2)处理后的离心管中加入40～50ml无水乙醇，冰浴静置1～2小时，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃上清并干燥。加入10～15ml丙酮，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃去上清液并烘干。

(4)不溶性非淀粉多糖组分解离：在(2)处理后的离心管中加入50～60ml磷酸缓冲液，沸水浴1～2小时，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃上清并干燥。加入10～15ml丙酮，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃去上清液并烘干。

(5)非淀粉多糖组分含量解析：将解离的非淀粉多糖组分中加入浓硫酸，30～40℃，40～50r/min恒温水浴1～2h，离心，置于-18～-22℃储存备用。取200～300μl水解液至离心管中，加入体积比为1:4:4:4～1:3:3:3的氨水：肌醇内标物：无水乙醇：硼氢化钠溶液，混匀。再加入体积为2:5:50～3:6:55的冰乙酸：1-甲基咪唑：乙酸酐的溶液，混匀。经氮气吹干复溶后，气相色谱测定总非淀粉多糖组分和不溶性非淀粉多糖组分。

所述步骤(1)中，粉碎后的饲料样品置于-18～-22℃储存备用。

所述步骤(5)中可溶性非淀粉多糖组分为总非淀粉多糖组分和不溶性非淀粉多糖组分之差。

本发明与现有技术相比的优点在于：

(1)本发明以大量实验数据为依据，规定适宜称样量、水解时间、试剂浓度等测试参数条件，保证饲料非淀粉多糖含量分析方法的稳定性。

(2)本发明克服了目前饲料中非淀粉多糖分析方法的测试不稳定性和结果高变异性，通过可溶性非淀粉多糖组分和不溶性非淀粉多糖组分有效的解离和非淀粉多糖组分解析，达到了准确获取饲料非淀粉多糖组分含量目的。

附图说明

图1为本发明实现的流程图；

图2为不同品种小麦样品非淀粉多糖组分分析图；

图3为不同小麦麸样品非淀粉多糖组分分析图。

具体实施方式

本发明采用本发明采用乙酸酐衍生的气相色谱法解析饲料非淀粉多糖组分，准确获取饲料中总非淀粉多糖组分含量、不溶性非淀粉多糖组分含量、可溶性非淀粉多糖组分含量。

下面结合附图及具体实施例详细介绍本发明。但以下的实施例仅限于解释本发明，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，不仅仅限于本实施例。

实施例1，

如图1所示，本发明具体实现方法可以如下方式实施：

选取小麦饲料原料放入粉碎机中，再将所述的粉碎机的转速控制5000～6000r/min，粉碎时间为5～10min，将粉碎后的饲料过35目筛；置于-18～-22℃储存备用；

饲料样品前处理：精确称取参比日粮纤维45～60mg和饲料0.20～0.25g至离心管中，加入20～30ml石油醚超声处理10～15min，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃上清并干燥。加入80％的乙醇超声处理，弃上清并干燥。加入10～15ml乙酸缓冲液(ph＝5.0)，并加入60～80μlα-淀粉酶，沸水浴。然后加入60～80μl淀粉葡糖苷酶50～60℃恒温震荡水浴10～12h。取出离心管冷却至室温，3000～5000r/min室温离心5～10min；

在所述饲料样品前处理后的离心管中加入40～50ml无水乙醇，冰浴静置1～2小时，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃上清并干燥。加入10～15ml丙酮，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃去上清液并烘干。

在所述饲料样品前处理后的离心管中加入50～60ml磷酸缓冲液，沸水浴1～2小时，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃上清并干燥。加入10～15ml丙酮，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃去上清液并烘干。

在所述的饲料样品非淀粉多糖组分解离后中加入浓硫酸，30～40℃，40～50r/min恒温水浴1～2h，离心，置于-18～-22℃储存备用。取200～300μl水解液至离心管中，加入体积比为1:4:4:4～1:3:3:3的氨水：肌醇内标物：无水乙醇：硼氢化钠溶液，混匀。再加入体积为2:5:50～3:6:55的冰乙酸：1-甲基咪唑：乙酸酐的溶液，混匀。经氮气吹干复溶后，气相色谱测定总非淀粉多糖组分和不溶性非淀粉多糖组分。

利用本发明公开的“饲料非淀粉多糖组分分析方法”测定八种小麦的非淀粉多糖组分含量如图2所示。小麦的总非淀粉多糖含量范围为：7.82～10.24，品种间的变异系数9.28％；小麦的不溶性非淀粉多糖含量范围为：6.66～8.73，品种间的变异系数9.71％；小麦的可溶性非淀粉多糖含量范围为：1.15～1.57，品种间的变异系数9.44％。

实施例2，

如图1所示，本发明具体实现方法可以如下方式实施：

选取小麦麸饲料原料放入粉碎机中，再将所述的粉碎机的转速控制5000～6000r/min，粉碎时间为5～10min，将粉碎后的饲料过35目筛；置于-18～-22℃储存备用；

饲料样品前处理：精确称取参比日粮纤维45～60mg和饲料0.15～0.20g至离心管中，加入20～30ml石油醚超声处理10～15min，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃上清并干燥。加入80％的乙醇超声处理，弃上清并干燥。加入10～15ml乙酸缓冲液(ph＝5.0)，并加入60～80μlα-淀粉酶，沸水浴。然后加入60～80μl淀粉葡糖苷酶50～60℃恒温震荡水浴10～12h。取出离心管冷却至室温，3000～5000r/min室温离心5～10min；

在所述饲料样品前处理后的离心管中加入40～50ml无水乙醇，冰浴静置1～2小时，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃上清并干燥。加入10～15ml丙酮，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃去上清液并烘干。

在所述饲料样品前处理后的离心管中加入50～60ml磷酸缓冲液，沸水浴1～2小时，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃上清并干燥。加入10～15ml丙酮，3000～5000r/min室温离心5～10min，弃去上清液并烘干。

在所述的饲料样品非淀粉多糖组分解离后中加入浓硫酸，30～40℃，40～50r/min恒温水浴1～2h，离心，置于-18～-22℃储存备用。取200～300μl水解液至离心管中，加入体积比为1:4:4:4～1:3:3:3的氨水：肌醇内标物：无水乙醇：硼氢化钠溶液，混匀。再加入体积为2:5:50～3:6:55的冰乙酸：1-甲基咪唑：乙酸酐的溶液，混匀。经氮气吹干复溶后，气相色谱测定总非淀粉多糖组分和不溶性非淀粉多糖组分。

利用本发明公开的“饲料非淀粉多糖组分分析方法”测定八种小麦麸的非淀粉多糖组分含量如图3所示。小麦麸的总非淀粉多糖含量范围为：30.41～38.25，品种间的变异系数6.37％；小麦麸的不溶性非淀粉多糖含量范围为：28.42～36.23，品种间的变异系数6.73％；小麦麸的可溶性非淀粉多糖含量范围为：1.78～2.42，品种间的变异系数10.42％。

需要说明的是，按照本发明上述各实施例，本领域技术人员是完全可以实现本发明独立权利要求及从属权利的全部范围的，实现过程及方法同上述各实施例；且本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。

以上所述，仅为本发明部分具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。