本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种中药复方中土槿皮的鉴别方法。
背景技术：
复方土槿皮酊为中药复方制剂，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第17册，标准号为：WS3－B－3269－98，具有杀菌止痒的功效，用于趾痒、皮肤滋痒、一般皮癣。其处方由土槿皮42g、苯甲酸125g、水杨酸62.5g三味组成，制法：以上三味，取土槿皮，加入适量乙醇，加热回流5小时，滤过；将苯甲酸、水杨酸用乙醇溶解，与土槿皮滤液合并，加乙醇制成1000ml，即得。
复方土槿皮酊质量标准中薄层鉴别的技术方案为：取本品2ml作为供试品溶液。另取土槿皮对照药材2g，加乙醇50ml，加热回流5小时，取回流液2ml，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，先以乙醚展开至前沿，取出，晾干，再以甲醇-浓氨试液(4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，于110℃下烘15分钟。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。孙红英等(复方土荆皮配质量标准研究，现代应用药学,1995,8:18-20.)对土槿皮酊中土荆乙酸的薄层鉴别技术方案为：取复方土荆皮酊20ml，挥干，残渣用苯适量溶解。滤过得苯液，将苯挥去，残渣用乙醚20ml分三次溶解，乙醚溶解部分置分液漏斗中，用5％碳酸氢钠液30ml分三次萃取，所得萃取液合并后，加盐酸酸化成酸性使多量白色沉淀析出，滤液继续酸化至白色沉淀完全析出，合并沉淀物，用水洗，抽干，以无水乙醚溶解得醚液，挥去乙醚，残渣用甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。取土荆皮乙酸对照品，加甲醇1ml使成1ml含1mg的溶液。取对照品土荆乙酸、供试品溶液各20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶H薄层板上，点样后放入层析缸内饱和30分钟后展开。挥尽溶剂后，喷以茴香醛-浓硫酸溶液。在105℃烘约10min。观察显色斑点，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
复方土槿皮酊质量标准中的薄层鉴别方法对复方土槿皮酊进行检验，检验结果表明，同一批次供试品色谱与对照药材色谱相应位置上，没有斑点或斑点不清晰，影响结果判定或误判产品质量不合格。究其原因是：①供试品溶液中化学成分复杂未做提纯处理，直接取供试品溶液点样，对检测成分造成干扰；②展开剂极性较大，造成展开后薄层斑点Rf过大，斑点容易重叠至溶剂前沿，未能达到有效分离，影响结果判定；③斑点检视为通用显色剂硫酸乙醇显色后日光检视，因硫酸乙醇溶液喷在薄层板上，对所有机化学成分都会显同一种颜色，无法区分不同类别的有机化学成分，专属性差，影响鉴别结果的判断。而孙红英等人的鉴别方法中供试品溶液前处理步骤繁琐，且需用到有毒试剂苯，非常不利于实验者健康及环境保护。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种中药复方中土槿皮的鉴别方法，具有色谱图斑点清晰易辨、简单便捷、灵敏度高、鉴别效率高和安全无污染等优点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种中药复方中土槿皮的鉴别方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：将待鉴别的样品加到聚酰胺柱上，先用乙醚-乙酸丁酯的混合溶液洗脱，再用有机溶剂A洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用有机溶剂A溶解，作为供试品溶液；
(2)对照药材溶液的制备：取土槿皮对照药材粉末，加有机溶剂B加热回流，滤液蒸干，残渣用有机溶剂B溶解，作为对照药材溶液；
(3)薄层色谱鉴别：取供试品溶液与对照药材溶液各2～6μL，分别点样于同一硅胶薄层色谱板上，以环己烷-乙酸乙酯的混合溶液作为展开剂，展开，取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
优选地，所述步骤(1)中所述乙醚-乙酸丁酯的混合溶液中乙醚和乙酸丁酯的体积比为(10～12):1。优选地，所述步骤(1)中有机溶剂A选自甲醇和乙醇中的至少一种。
优选地，所述甲醇或乙醇的体积分数为80％～100％。
优选地，所述步骤(2)中有机溶剂B选自甲醇和乙醇中的至少一种。
优选地，所述甲醇或乙醇的体积分数为80％～100％。优选地，所述步骤(2)中加有机溶剂B加热回流的时间为5h。
优选地，所述步骤(3)中硅胶薄层色谱板选自硅胶H自制板或硅胶H预制板。
优选地，所述步骤(3)中环己烷-乙酸乙酯的混合溶液中环己烷和乙酸乙酯的体积比为(2.3～4)：1。
优选地，所述步骤(1)中有机溶剂A与待鉴别样品的体积比为(6～20):1；所述步骤(2)中土槿皮对照药材与有机溶剂B的重量体积比为1g：(15～200)mL。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明利用柱层析技术对供试品溶液进行前处理，提纯去杂，并使用特定比例的乙醚-乙酸丁酯混合洗脱液进行洗脱，在有效清除供试品中杂质的同时主成分损失较小，得到供试品溶液色谱图斑点清晰易辨；(2)本发明鉴别方法的薄层展开条件中，所用试剂均为毒性较小的溶剂，有利于操作者健康及环境的保护；经试验摸索，得到选用环己烷-乙酸乙酯的混合溶液作为展开剂，且环己烷和乙酸乙酯的体积比为(2.3～4)：1时，能使目标成分斑点有效分离且斑点Rf值适中；耐用性试验证明该展开方法耐用性良好；(3)斑点检视改用专属性较强的紫外灯检视，避免使用原标准中通用硫酸乙醇显色剂，能有效减少杂质斑点对结果的影响。
附图说明
图1为本发明鉴别方法专属性实验结果，其中，1：复方土槿皮酊E10026批；2：复方土槿皮酊E10027批；3：复方土槿皮酊D12128批；4：复方土槿皮酊E10029批；5：复方土槿皮酊E11030批；6：复方土槿皮酊G01001批；7：复方土槿皮酊G02003批；8：复方土槿皮酊G03006批；9：复方土槿皮酊G03007批；10：复方土槿皮酊G05008批；11：土槿皮对照药材；12：阴性对照品。
图2为本发明中药复方中土槿皮鉴别方法和现有中药复方中土槿皮鉴别方法的效果对比实验结果，其中，1：复方土槿皮酊G02003批；2：土槿皮对照药材。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明所用试验材料可选择如下材料，但实际实施时并不限于如下材料：
试剂：硅胶H(批号150308)青岛海洋化工厂生产，自制板规格10×20mm，厚度0.5mm；预制板为青岛海洋化工厂生产，规格10×20mm，厚度0.2～0.25mm。其它所用试剂为分析纯。
对照药材：土槿皮对照药材(批号121281-201002)，购于中国食品药品检定研究院。
供试品：复方土槿皮酊10批(批号E10026、E10027、D12128、E10029、E11030、G01001、G02003、G03006、G03007、G05008)，为广州白云山敬修堂药业股份有限公司生产。
实施例1
本发明中药复方中土槿皮的鉴别方法的一种实施例，对复方土槿皮酊中土槿皮进行鉴别，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：
取复方土槿皮酊(批号E10026、E10027、D12128)5ml加在聚酰胺柱上，先用乙醚和乙酸丁酯体积比为12:1的乙醚-乙酸丁酯混合溶液洗脱，弃去洗脱液，再用30ml体积分数为80％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用1ml体积分数为80％的乙醇溶液溶解，作为供试品溶液；
(2)对照药材溶液的制备：
取土槿皮对照药材粉末1g，加30ml体积分数为80％的乙醇溶液加热回流5小时，滤液蒸干，残渣用1ml体积分数为80％的乙醇溶液溶解，作为对照药材溶液；
(3)采用薄层色谱鉴别法对供试品进行鉴别：
取供试品溶液与对照药材溶液各2μL，分别点样于同一硅胶H自制板上，以环己烷和乙酸乙酯体积比为4:1的环己烷-乙酸乙酯的混合溶液作为展开剂，上行展开，将展开完毕的薄层板取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，说明供试品为合格品。
实施例2
本发明中药复方中土槿皮的鉴别方法的一种实施例，对复方土槿皮酊中土槿皮进行鉴别，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：
取复方土槿皮酊(批号E10029、E11030、G01001)5ml加在聚酰胺柱上，先用乙醚和乙酸丁酯体积比为11:1的乙醚-乙酸丁酯混合溶液洗脱，弃去洗脱液，再用50ml体积分数为90％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用1ml体积分数为90％的乙醇溶液溶解，作为供试品溶液；
(2)对照药材溶液的制备：
取对照药材粉末1g，加50ml体积分数为90％的乙醇溶液加热回流5小时，滤液蒸干，残渣用1ml体积分数为90％的乙醇溶液溶解，作为对照药材溶液；
(3)采用薄层色谱鉴别法对供试品进行鉴别：
取供试品溶液与对照药材溶液各3μL，分别点样于同一硅胶H预制板上，以环己烷和乙酸乙酯体积比为7:2的环己烷-乙酸乙酯的混合溶液作为展开剂，上行展开，将展开完毕的薄层板取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，说明供试品为合格品。
实施例3
本发明中药复方中土槿皮的鉴别方法的一种实施例，对复方土槿皮酊中土槿皮进行鉴别，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：
取复方土槿皮酊(批号G02003、G03006、G03007)5ml加在聚酰胺柱上，先用乙醚和乙酸丁酯体积比为10:1的乙醚-乙酸丁酯混合溶液洗脱，弃去洗脱液，再用100ml无水乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用1ml无水乙醇溶解，作为供试品溶液；
(2)对照药材溶液的制备：
取对照药材粉末1g，加100ml无水乙醇加热回流5小时，滤液蒸干，残渣用1ml无水乙醇溶解，作为对照药材溶液；
(3)采用薄层色谱鉴别法对供试品进行鉴别：
取供试品溶液与对照药材溶液各5μL，分别点样于同一硅胶H预制板上，以环己烷和乙酸乙酯体积比为8:3的环己烷-乙酸乙酯的混合溶液作为展开剂，上行展开，将展开完毕的薄层板取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，说明供试品为合格品。
实施例4
本发明中药复方中土槿皮的鉴别方法的一种实施例，对复方土槿皮酊中土槿皮进行鉴别，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：
取复方土槿皮酊(批号G02003、G03006、G03007)5ml加在聚酰胺柱上，先用乙醚和乙酸丁酯体积比为10:1的乙醚-乙酸丁酯混合溶液洗脱，弃去洗脱液，再用30ml无水甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用1ml无水甲醇溶解，作为供试品溶液；
(2)对照药材溶液的制备：
取对照药材粉末1g，加30ml无水甲醇加热回流5小时，滤液蒸干，残渣用1ml无水甲醇溶解，作为对照药材溶液；
(3)采用薄层色谱鉴别法对供试品进行鉴别：
取供试品溶液与对照药材溶液各6μL，分别点样于同一硅胶H预制板上，以环己烷和乙酸乙酯体积比为7:3的环己烷-乙酸乙酯的混合溶液作为展开剂，上行展开，将展开完毕的薄层板取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，说明供试品为合格品。
实施例5
本发明中药复方中土槿皮的鉴别方法的一种实施例，对复方土槿皮酊中土槿皮进行鉴别，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：
取复方土槿皮酊(批号G03006、G03007、G05008)5ml加在聚酰胺柱上，先用乙醚和乙酸丁酯体积比为12:1的乙醚-乙酸丁酯混合溶液洗脱，弃去洗脱液，再用100ml体积分数为90％的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用1ml体积分数为90％的甲醇溶液溶解，作为供试品溶液；
(2)对照药材溶液的制备：
取对照药材粉末1g，加100ml体积分数为90％的甲醇溶液加热回流5小时，滤液蒸干，残渣用1ml体积分数为90％的甲醇溶液溶解，作为对照药材溶液；
(3)采用薄层色谱鉴别法对供试品进行鉴别：
取供试品溶液与对照药材溶液各5μL，分别点样于同一硅胶H自制板上，以环己烷和乙酸乙酯体积比为7:3的环己烷-乙酸乙酯的混合溶液作为展开剂，上行展开，将展开完毕的薄层板取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，说明供试品为合格品。
实施例6
本发明中药复方中土槿皮的鉴别方法的一种实施例，对复方土槿皮酊中土槿皮进行鉴别，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：
取复方土槿皮酊(批号G02003、G03006、G03007)5ml加在聚酰胺柱上，先用乙醚和乙酸丁酯体积比为10:1的乙醚-乙酸丁酯混合溶液洗脱，弃去洗脱液，再用50ml体积分数为80％的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用1ml体积分数为80％的甲醇溶液溶解，作为供试品溶液；
(2)对照药材溶液的制备：
取对照药材粉末1g，加50ml体积分数为80％的甲醇溶液加热回流5小时，滤液蒸干，残渣用1ml体积分数为80％的甲醇溶液溶解，作为对照药材溶液；
(3)采用薄层色谱鉴别法对供试品进行鉴别：
取供试品溶液与对照药材溶液各5μL，分别点样于同一硅胶H预制板上，以环己烷和乙酸乙酯体积比为8:3的环己烷-乙酸乙酯的混合溶液作为展开剂，上行展开，将展开完毕的薄层板取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，说明供试品为合格品。
实施例7本发明鉴别方法的专属性
本实施例验证本发明鉴别方法的专属性。
(1)供试品溶液的制备：
取复方土槿皮酊10批(批号E10026、E10027、D12128、E10029、E11030、G01001、G02003、G03006、G03007、G05008)5ml加在聚酰胺柱上，先用乙醚和乙酸丁酯体积比为12:1的乙醚-乙酸丁酯混合溶液洗脱，弃去洗脱液，再用50ml无水乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用1ml无水乙醇溶解，作为供试品溶液；
(2)对照药材溶液的制备：
取对照药材粉末1g，加50ml无水乙醇加热回流5小时，滤液蒸干，残渣用1ml无水乙醇溶解，作为对照药材溶液；
(3)阴性供试品溶液的制备：
取苯甲酸125g和水杨酸62.5g，照复方土槿皮酊的制法，制成不含土槿皮的阴性对照品，再照供试品溶液的制法，制成不含土槿皮的阴性供试品溶液；
(4)采用薄层色谱鉴别法对供试品进行鉴别：
取供试品溶液、对照药材溶液和阴性供试品溶液各5μL，分别点样于同一硅胶H预制板上，以环己烷和乙酸乙酯体积比为7:3的环己烷-乙酸乙酯的混合溶液作为展开剂，上行展开，将展开完毕的薄层板取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视。
色谱识别结果如图1所示，结果表明，供试品色谱中，在与对照药材土槿皮色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，说明供试品为合格品；阴性供试品色谱中，在与对照药材土槿皮色谱相应的位置上，未显相同颜色的荧光斑点，说明阴性对照品无干扰。上述结果表明本发明薄层鉴别方法专属性较强。
实施例8本发明鉴别方法的耐用性
本实施例验证本发明鉴别方法的耐用性。
1、不同薄层板的比较：选取手铺H-CMC.Na与预制硅胶H板，分别按拟定的试验方法试验。结果表明，自制板和预制板均能达到鉴别要求。
2、不同相对湿度的比较：取点样后的薄层板，分别用硫酸调节湿度为32％和72％的层析缸中展开，检视。结果表明相对湿度32％和72％的环境对色谱无明显影响。
3、不同温度的比较：将已有展开剂的层析缸置于冰箱中(4℃)，放置一段时间后，将点样后的薄层板放入层析缸中，展开，检视。结果表明，低温条件下的薄层斑点清晰，分离度较好，与常温的薄层展开情况相似，表明低温对该薄层鉴别方法无明显影响。
上述试验表明，本发明的复方土槿皮酊的薄层鉴别方法在薄层板方面，手铺板和预制板均能达到分离效果；温度、湿度变化对展开效果影响不大。因此该方法耐用性良好，符合《<中国药典>中药质量标准研究制定技术要求》中有关耐用性的规定。
对比例1
本对比例研究本发明中药复方中土槿皮鉴别方法与现有鉴别方法的效果差异。
(一)实验方法
1、本发明中药复方中土槿皮鉴别方法
(1)供试品溶液的制备：
取复方土槿皮酊(批号G02003)5ml加在聚酰胺柱上，先用乙醚和乙酸丁酯体积比为10:1的乙醚-乙酸丁酯混合溶液洗脱，弃去洗脱液，再用50ml无水乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用1ml无水乙醇溶解，作为供试品溶液；
(2)对照药材溶液的制备：
取对照药材粉末1g，加50ml无水乙醇加热回流5小时，滤液蒸干，残渣用1ml无水乙醇溶解，作为对照药材溶液；
(3)采用薄层色谱鉴别法对供试品进行鉴别：
取供试品溶液和对照药材溶液各5μL，分别点样于同一硅胶H预制板上，以环己烷和乙酸乙酯体积比为8:3的环己烷-乙酸乙酯的混合溶液作为展开剂，上行展开，将展开完毕的薄层板取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视。
色谱识别：供试品色谱中，在与对照药材土槿皮色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，说明供试品为合格品。
2、中药复方中土槿皮现有鉴别方法
(1)供试品溶液的制备：
取复方土槿皮酊(批号G02003)2ml作为供试品溶液；
(2)对照药材溶液的制备：
取土槿皮对照药材2g，加50ml无水乙醇，加热回流5小时，取回流液2ml，作为对照药材溶液；
(3)采用薄层色谱鉴别法对供试品进行鉴别：
取供试品溶液和对照药材溶液各10μL，分别点样于同一硅胶G预制板上，先用乙醚上行展开至前沿，取出，晾干，再用甲醇和浓氨体积比为4：1的甲醇-浓氨试液上行展开，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，于110℃下烘15分钟。
色谱识别：供试品色谱中，在与对照药材土槿皮色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，说明供试品为合格品。
(二)实验结果
实验结果如图2所示，结果表明，本发明复方土槿皮酊鉴别方法鉴别技术专属性、灵敏度和分离效果等指标均优于现有技术。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。