本发明属于均相化学发光检测
技术领域：
，具体涉及一种ctni均相化学发光检测试剂盒、检测方法与装置。
背景技术：
：目前，生物大分子人心肌肌钙蛋白i(ctni)检测常用elisa法、胶体金法以及均相化学发光分析等。化学发光分析法是一种利用化学发光物质发射的光波进行检测的方法。化学发光物质作为标记应用于核酸检测与免疫检测中。例如，可通过多种途径将特异结合对中的某一分子与发光物质结合形成发光复合物。该复合物可与样品中被检测物(特异结合对中的另一分子)反应，分配于固相与液相中，且分配比例与检测物的量相关。通过测定固相或液相中发光量，即可得出样品中检测物的相应浓度。化学发光分析中供体微球和受体微球的发光效率决定了化学发光分析法的检测灵敏度。为了提高供体微球和/或受体微球的发光效率，本领域一般采用提高供体微球中染料的感光效率和/或受体微球中发光化合物的接受光的效率和发光效率的方法。虽然采用本领域所述方法可极大地提高化学发光检测法的检测灵敏度，但是仍需要开发一种能在现有技术基础上进一步提高发光效率以检测人心肌肌钙蛋白i的方法。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足提供一种ctni均相化学发光检测试剂盒，采用该试剂盒检测人心肌肌钙蛋白i的方法具有很高的检测灵敏度。为此本发明第一方面提供了一种ctni均相化学发光检测试剂盒，其包括：供体试剂，其包括供体微球以及与之结合的第一标记物，所述供体微球能够在激发状态产生活性氧；和，受体试剂，其包括受体微球以及与之结合的第一结合单元，所述受体微球能够与活性氧反应生成可检测的化学发光信号，所述第一结合单元能够与人心肌肌钙蛋白i的第一表位特异性结合；其中，所述供体微球的粒径不小于受体微球的粒径。在本发明的一些实施方式中，所述供体微球与受体微球的粒径选自20nm-400nm，优选选自50nm-350nm，更优选选自100nm-300nm，最优选为150nm-250nm。在本发明的一些优选的实施方式中，所述供体微球的粒径等于受体微球的粒径。在本发明的一些优选的具体实施方式中，所述供体微球与受体微球的粒径均为200nm。在本发明的一些优选的实施方式中，所述供体微球的粒径大于受体微球的粒径。在本发明的一些优选的具体实施方式中，所述供体微球与受体微球的粒径比为1.06-8.60，优选为1.2-4.0，更优选为1.5-2.01。在本发明的一些实施方式中，所述供体微球表面包裹有亲水性的醛基葡聚糖。在本发明的另一些实施方式中，所述受体微球表面包裹有亲水性的羧基葡萄糖。在本发明的一些实施方式中，所述供体微球中填充有光敏剂，所述光敏剂选自亚甲基蓝、玫瑰红、卟碄和酞菁中的一种。在本发明的另一些实施方式中，所述发光微球中填充有发光化合物；优选地，所述发光化合物为铕配合物；进一步优选地，所述铕配合物为mtta-eu3+。在本发明的一些实施方式中，所述供体微球和受体微球均为聚苯乙烯材质微球。在本发明的另一些实施方式中，所述活性氧为单线态氧。在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括第一试剂，其包含第二结合单元以及与之结合的第一标记物的特异结合物，所述第二结合单元能够与人心肌肌钙蛋白i的第二表位特异性结合，所述第二表位与所述第一表位是人心肌肌钙蛋白i的不同结合特性的表位或者不同位置的相同结合特性的表位。在本发明的一些优选的实施方式中，所述第一结合单元和所述第二结合单元分别独立选自与人心肌肌钙蛋白i具有结合特异性的多克隆抗体、单克隆抗体、抗体结合片段、人工抗体、修饰的抗体，优选选自多克隆抗体和/或单克隆抗体。在本发明的一些优选的具体实施方式中，所述第一结合单元和/或所述第二结合单元独立包含至少两种能够与人心肌肌钙蛋白i的不同结合特性的表位或者不同位置的相同结合特性的表位具有结合特异性的不同的单克隆抗体、抗体结合片段、人工抗体或修饰的抗体。在本发明的一些实施方式中，所述第一标记物选自亲和素和/或链霉亲和素。在本发明的一些优选的实施方式中，所述受体试剂中的所述受体微球的浓度选自20～300μg/ml，优选30～200μg/ml，更优选40～100μg/ml。在本发明的另一些优选的实施方式中，所述供体试剂中的所述供体微球的浓度选自0.2～10μg/ml，优选0.5～8μg/ml，更优选1～6μg/ml。本发明第二方面提供了一种人心肌肌钙蛋白i均相化学发光检测方法，其使用如本发明第一方面所述的试剂盒进行化学发光检测。在本发明的一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：s1，将待测样本与受体试剂及供体试剂混合形成待测混合物；s2，利用能量或者活性化合物激发所述待测混合物化学发光，测量所述化学发光的信号强度；其中，所述供体试剂包括供体微球，所述供体微球能够在激发状态产生活性氧；所述受体试剂包括受体微球，所述受体微球能够与活性氧反应生成可检测的化学发光信号；所述供体微球的粒径不小于所述受体微球的粒径。本发明第三方面提供了一种化学发光检测装置，其利用如本发明第一方面所述的试剂盒或本发明第二发明所述的方法检测待测样本中的人心肌肌钙蛋白i。在本发明的一些优选的实施方式中，所述装置为poct即时检测装置。本发明的有益效果为：本发明所述试剂盒通过控制受体微球和供体微球的基质和粒径，使得将所述试剂盒用于化学发光检测人心肌肌钙蛋白i时，提高了检测的发光效率，具有很好的检测灵敏度。另外，本发明中试剂盒中的受体微球和供体微球均为聚苯乙烯微球，且受体微球表面包裹有亲水性的羧基葡萄糖，供体微球表面包裹有亲水性的醛基葡聚糖，大大降低了非特异性吸附，减少体系外其他环境因素如ph值及电解质等的影响，进而可以提高检测的准确性。具体实施方式为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。除非另有定义，本文使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。ⅰ.术语本发明所述用语“均相”所对应的英文定义为“homogeneous”，其是指无须对结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗原或抗体进行分离即可进行检测。本发明所述用语“待测样本”是指可能含有被分析物的一种混合物，被分析物包括但不限于蛋白质、激素、抗体或抗原。可以被用在本发明公开的方法中的典型待测样本包括体液，如全血、血清、血浆、唾液和尿等。待测样本可以在使用前根据需要利用稀释液进行稀释。例如，为了避免hook效应，可以在上机检测前使用稀释液对待测样本进行稀释后再在检测仪器上进行检测。本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用，包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。本发明所述用语“特异性结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。在本发明公开的技术思想下，特异性结合反应的检测方法包括但不限于：双抗体夹心法、竞争法、中和竞争法、间接法或捕获法。在本发明中，所述“供体微球”可以是通过功能基团被包被在基体上形成填充有光敏剂的高分子微粒，在光激发下能够产生活性氧(如，单线态氧)，此时供体微球也可以称为感光微球或感光微粒。所述供体微球表面有亲水性的醛基葡聚糖，内部填充有光敏剂。所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂，优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物，其非限定性的例子包括亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、和酞菁等化合物，以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物，所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。所述供体微球表面还可以填充其他敏化剂，其非限定性的例子是某些化合物，它们催化过氧化氢转化为单线态氧和水。其他一些供体的例子包括：1,4-二羧基乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物等，加热这些化合物或者这些化合物直接吸收光会释放单线态氧。所述“受体微球”可以是通过功能基团被包被在基体上形成填充有发光化合物的高分子微粒，此时可以称为发光微球或发光微粒。所述发光微球受体微球表面有亲水性的羧基葡聚糖，内部填充有能够与活性氧(如，单线态氧)发生反应的化学发光剂。在本发明的一些具体实施例中，所述化学发光剂，其经历与单线态氧的化学反应以形成不稳定的亚稳态中间体，所述亚稳态中间体可以分解，同时或随后发光。在本发明的一些优选实施例中，所述发光化合物为铕配合物；进一步优选地，所述铕配合物为mtta-eu3+。本发明所述用语“单克隆抗体”是指由单克隆的b淋巴细胞分泌的免疫球蛋白，其可以通过本领域技术人员所公知的方法来制备得到。本发明所述用语“多克隆抗体”是指由一个以上的b淋巴细胞克隆产生的免疫球蛋白集合，其可以通过本领域技术人员所公知的方法来制备得到。本发明所述用语“生物素”广泛存在于动植物组织中，其分子上有两个环状结构，分别为咪唑酮环和噻吩环，其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等；而“链霉亲和素”是由链霉菌分泌的一种蛋白质，分子量为65kd。“链霉亲和素”分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子，从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。在任何需要的情况下，本发明中所用任何试剂，包括抗原、抗体、受氧微球或供氧微球，可以根据实际需要缀合生物素-链霉亲和素特异性结合配对成员中的任一员。本发明所述用语“粒径”是指微球的平均粒径，它是用常规粒径仪测定的。ⅱ.具体实施方案下面将更详细地说明本发明。本发明第一方面所涉及的ctni均相化学发光检测试剂盒，其包括：供体试剂，其包括供体微球以及与之结合的第一标记物，所述供体微球能够在激发状态产生活性氧；和，受体试剂，其包括受体微球以及与之结合的第一结合单元，所述受体微球能够与活性氧反应生成可检测的化学发光信号，所述第一结合单元能够与人心肌肌钙蛋白i的第一表位特异性结合；其中，所述供体微球的粒径不小于受体微球的粒径。本发明通过控制试剂盒内供体微球和受体微球粒径的关系，使得将所述试剂盒用于化学发光检测人心肌肌钙蛋白i时，提高了检测的发光效率，具有很好的检测灵敏度。在本发明的一些实施方式中，所述供体微球与受体微球的粒径选自20nm-400nm，优选选自50nm-350nm，更优选选自100nm-300nm，最优选为150nm-250nm。如，在本发明的一些具体实施例中，所述供体微球与受体微球的粒径可以为20nm、50nm、70nm、90nm、100nm、120nm、140nm、160nm、180nm、200nm、220nm、240nm和250nm。在本发明的一些优选的实施方式中，所述供体微球的粒径等于受体微球的粒径。在本发明的一些优选的具体实施方式中，所述供体微球与受体微球的粒径均为200nm。在本发明的一些优选的实施方式中，所述供体微球的粒径大于受体微球的粒径。在本发明的一些优选的具体实施方式中，所述供体微球与受体微球的粒径比为1.06-8.60，优选为1.2-4.0，更优选为1.5-2.01。如，在本发明的一些具体实施方式中，所述供体微球的粒径为150nm，所述受体微球的粒径为100nm，所述供体微球与受体微球的粒径比为1.5。在本发明的一些实施方式中，所述供体微球表面包裹有亲水性的醛基葡聚糖。在本发明的另一些实施方式中，所述受体微球表面包裹有亲水性的羧基葡萄糖。采用上述微球进行检测时，可以大大降低非特异性吸附，减少体系外其他环境因素如ph值及电解质等的影响，从而提高检测的准确性。在本发明的一些实施方式中，所述供体微球中填充有光敏剂，所述光敏剂选自亚甲基蓝、玫瑰红、卟碄和酞菁中的一种。在供体微球中光敏剂的载带量无特别的限制，它可以是本领域常用的量。在本发明的另一些实施方式中，所述受体微球中填充有发光化合物。在本发明的一些优选实施方式中，所述发光化合物为铕配合物。填充在聚苯乙烯微球中的铕配合物与聚苯乙烯微球相互作用，进一步提高其发光效率。在本发明进一步优选的实施方式中，所述铕配合物为mtta-eu3+，此配合物可以直接捕获感光微球内酞菁染料产生的单线态氧后发出铕离子特征波长614-615nm的红光。mtta：[4’-(10-甲基-9-蒽基)-2,2’:6’2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺]四乙酸，其结构式如式ⅰ所示,合成参考cn200510130851.9。铕配合物mtta-eu3+(铕(ⅲ)配合物)的合成如下：(1)取500ml三口烧瓶，将732mgmtta(1mmol)和366mgeucl3·6h2o(1mmol)，溶于100ml甲醇中，搅拌下70℃回流2小时。(2)减压蒸馏除去溶剂。(3)生成物中加入50ml乙醚，过滤收集滤饼，并用丙酮洗涤三次。(4)真空干燥后得到830mgmtta-eu3+。在本发明的一些实施方式中，所述供体微球和受体微球均为聚苯乙烯材质微球。在本发明的另一些实施方式中，所述活性氧为单线态氧。在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括第一试剂，其包含第二结合单元以及与之结合的第一标记物的特异结合物，所述第二结合单元能够与人心肌肌钙蛋白i的第二表位特异性结合，所述第二表位与所述第一表位是人心肌肌钙蛋白i的不同结合特性的表位或者不同位置的相同结合特性的表位。所述第一试剂的浓度可以选自60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、160μg/ml、180μg/ml或200μg/ml。在本发明的一些优选的实施方式中，所述第一结合单元和所述第二结合单元分别独立选自与人心肌肌钙蛋白i具有结合特异性的多克隆抗体、单克隆抗体、抗体结合片段、人工抗体、修饰的抗体，优选选自多克隆抗体和/或单克隆抗体。在本发明的一些优选的具体实施方式中，所述第一结合单元和/或所述第二结合单元独立包含至少两种能够与人心肌肌钙蛋白i的不同结合特性的表位或者不同位置的相同结合特性的表位具有结合特异性的不同的单克隆抗体、抗体结合片段、人工抗体或修饰的抗体。在本发明的一些实施方式中，所述第一标记物选自亲和素和/或链霉亲和素。在本发明的一些优选的实施方式中，所述受体试剂中的所述受体微球的浓度选自20～300μg/ml，优选30～200μg/ml，更优选40～100μg/ml。在本发明的一些具体实施方式中，所述受体试剂中受体微球的浓度可以包括但不限于选自50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、140μg/ml、150μg/ml、160μg/ml、180μg/ml或200μg/ml。在本发明的另一些优选的实施方式中，所述供体试剂中的所述供体微球的浓度选自0.2～10μg/ml，优选0.5～8μg/ml，更优选1～6μg/ml。在本发明的一些具体实施方式中，所述供体试剂中供体微球的浓度可以包括但不限于选自1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml或7μg/ml。在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒中还包括稀释液，所述稀释液用于稀释待测样本。所述稀释液包括缓冲液、蛋白、稳定剂、防腐剂等。所述稀释液具有稀释和缓冲的作用，提高了最终检测结果的准确性和待测样本的稳定性。本发明第二方面提供了一种人心肌肌钙蛋白i均相化学发光检测方法，其使用如本发明第一方面所述的试剂盒进行化学发光检测。在本发明的一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：s1，将待测样本与受体试剂及供体试剂混合形成待测混合物；s2，利用能量或者活性化合物激发所述待测混合物化学发光，测量所述化学发光的信号强度；其中，所述供体试剂包括供体微球，所述供体微球能够在激发状态产生活性氧；所述受体试剂包括受体微球，所述受体微球能够与活性氧反应生成可检测的化学发光信号；所述供体微球的粒径不小于所述受体微球的粒径。在本发明的一些实施方式中，步骤s1中，首先将待测样本与受体试剂混合形成第一混合物，然后再将第一混合物与供体试剂混合形成待测混合物。在本发明的另一些实施方式中，步骤s2中，利用600～700nm的红色激发光照射待测混合物激发其发生化学发光。在本发明的一些优选的实施方式中，在步骤s1中，先将所述待测样本利用稀释液稀释后，再与所述受体试剂及供体试剂混合形成待测混合物。所述稀释液包括缓冲液、蛋白、稳定剂、防腐剂等。所述稀释液具有稀释和缓冲的作用，提高了最终检测结果的准确性和待测样本的稳定性。本发明第三方面提供了一种化学发光检测装置，其利用如本发明第一方面所述的试剂盒或本发明第二发明所述的方法检测待测样本中的人心肌肌钙蛋白i。在本发明的一些优选的实施方式中，所述装置为poct即时检测装置。在本发明的一些实施方式中，所述装置包括：a.试剂杯条，其上设有若干盛装试剂的孔位，所述孔位至少包括：待测样本孔位，其用于盛装包含待测目标分子的待测样本；第一试剂孔位，其用于盛装包含供体微球的供体试剂，所述供体微球能够在激发状态下产生活性氧；第二试剂孔位，其用于盛装包含受体微球的受体试剂，所述受体微球能够与活性氧反应产生化学发光信号，且所述供体微球的粒径不小于受体微球的粒径；b.加样机构，其用于将所述孔位中盛装的试剂在各孔位之间相互移动；所述加样机构每次转移的物质为1-500μl；c.检测机构，其与所述加样机构电连接，用于检测受体微球与活性氧反应所产生的化学发光信号。在本发明的另一些实施方式中，所述待测样本孔位、所述供体试剂孔位和所述受体试剂孔位均覆膜封闭孔口，以保证其中物质的不被污染。所述覆膜可以是一次性封膜也可以是反复使用的封膜。为方便识别和读取待测样本的信息，优选的技术方案是，所述试剂杯条沿宽度方向的侧面设有条形码区，所述条形码区包含所述试剂杯条的信息。所述条形码可以为一维或二维码。对应的，所述poct装置还包括条码扫描模块，所述条码扫描模块用于识别读取条形码中的信息。所述条码扫描模块支持ic卡扫描、印刷条形码介质(纸张或试剂卡)扫描，信息读入采用接触式扫描或者是非接触式扫描，其方式可以是红外或射频等方式；所述信息包括但不限于检测分析项目名称、标准曲线、试剂组分、批号、效期、生产商信息。为提高最终检测结果的准确性和待测样本的稳定性，在本发明的一些实施方式中，所述试剂杯条上还开设有稀释液孔位，所述稀释液孔位用来盛装稀释液。在本发明的一些实施方式中，所述试剂杯条上还开设有附加试剂孔位，所述附加试剂孔位用来盛装附加试剂，所述附加试剂孔位覆膜封闭孔口。在本发明的一些优选的实施方式中，所述加样机构包括：移液组件，用于抽吸或者排放液体；竖直移动组件，所述移液组件设置在所述竖直移动组件上，所述竖直移动组件用于带动所述移液组件竖直移动；水平移动组件，所述竖直移动组件设置在所述水平移动组件上，所述水平移动组件用于带动所述移液组件水平移动。在本发明的一些优选的实施方式中，所述检测机构包括：底座，用于承载所述试剂杯条；驱动组件，用于驱动所述底座绕其中心转动，并带动所述试剂杯条进行转动；检测组件，用于检测所述试剂杯条中的受体微球与活性氧反应所产生的化学发光信号。在本发明的一些具体的实施方式中，所述检测组件包括激发器，所述激发器能够发射600～700nm的红色激发光。在本发明的一些实施方式中，所述受体微球与活性氧反应所产生的化学发光信号的检测波长为450-650nm。在本发明的一些优选的实施方式中，所述移液组件包括从上至下依次设置的活塞机构、连接件和移液管，所述活塞机构连接所述连接件，所述移液管设置在所述底座的端面边缘处；在需要进行液体转移时，所述连接件下降并连接所述移液管，所述活塞机构能够上下移动以带动所述移液管抽吸或排放液体。在本发明的一些实施方式中，所述装置还包括温育模块，所述温育模块用于为化学发光反应提供合适的环境温度。在检测时，所述温育模块采用金属浴、水浴或油浴等方式，使所述试剂杯条及试剂杯条内物质的温度为温度为20-50℃。在本发明的另一些实施方式中，所述待测样本孔位、所述供体试剂孔位以及所述受体试剂孔位的横截面的形状互不相同。所述装置的使用流程为：在所述待测样本孔位、供体试剂孔位以及所述受体试剂孔位分别盛装待测样本、供体试剂和受体试剂后，将所述试剂卡置于所述poct分析仪中，利用加样机构取相应体积待测样本，加入第一试剂孔位，经过一定时间反应后，继续取一定体积混合后液体加入第二试剂孔位，所述检测组件中的激发器用于发射激光向第二试剂孔位照射，经过一定时间反应，所述检测机构检测受体微球与活性氧反应所产生的化学发光信号，计算出待测样本中的人心肌肌钙蛋白i的浓度。ⅲ.实施例为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。实施例1：ctni均相化学发光检测试剂盒一、受体微球的制备1、准备25ml的圆底烧瓶，加入0.1g铕(ⅲ)配合物，10ml95％乙醇，磁力搅拌，水浴升温至70℃，获得铕(ⅲ)配合物溶液。2、准备100ml的三口烧瓶，加入10ml95％乙醇、10ml水和10ml浓度为10％、粒径200nm的包被有羧基葡聚糖水凝胶的聚苯乙烯微球，磁力搅拌，水浴升温至70℃。3、将步骤1中的铕(ⅲ)配合物溶液缓慢滴加至步骤2中的三口烧瓶中，70℃反应2小时后停止搅拌，自然冷却，得到乳液。4、将上述乳液离心1小时，30000g，离心后弃去上清液，然后用50％乙醇重新悬浮。重复离心清洗3次后用ph值＝10的50mmcb缓冲液重新悬浮，使其终浓度为20mg/ml，获得粒径为200nm的受体微球溶液。5、用同样的方法制得粒径分别为100nm、150nm、250nm、300nm和350nm的受体微球溶液。二、受体微球偶联抗体1.按制备量量取10mg的包被有羧基葡聚糖水凝胶的受体微球于离心管中，10000rpm，离心60min。2.弃上清，向沉淀中加入2mg的anti-ctni抗体ⅰ，50μl的tween-20(50mg/ml)，再补加一定体积的0.05mmesph＝6.0，使受体微球终浓度为10mg/ml。3.超声迅速混匀。4.向离心管加入50μl的nabh3cn(50mg/ml，0.05mmesph＝6.0配制)混匀，37℃置于旋转混合仪反应36-48h。5.封闭：加入1ml的bsa(50mg/ml，0.05mmesph＝6.0配制)，37℃置于旋转混合仪反应12-16h。6.清洗：用0.05mmes缓冲液清洗3次。7.取样测定清洗完毕的偶联抗体的受体微球的浓度、粒径、信号值。三、供体微球的制备1、准备25ml的圆底烧瓶，加入0.1g酞菁铜(ⅱ)、10mldmf，磁力搅拌，水浴升温至70℃，获得酞菁铜(ⅱ)溶液。2、准备100ml的三口烧瓶，加入10ml95％乙醇、10ml水和10ml浓度为10％、粒径200nm的包被有醛基葡聚糖水凝胶的聚苯乙烯微球，磁力搅拌，水浴升温至70℃。3、将步骤1中的酞菁铜(ⅱ)溶液缓慢滴加至步骤2中的三口烧瓶中，70℃反应2小时后停止搅拌，自然冷却，得到乳液。4、将上述乳液离心1小时，30000g，离心后弃去上清液，用50％乙醇重新悬浮。重复离心清洗3次后用ph值＝10的50mmcb缓冲液重新悬浮，使其终浓度为20mg/ml，获得粒径为200nm的供体微球溶液。5、用同样的方法制得粒径分别为80nm、100nm、150nm、250nm、300nm和350nm的供体微球溶液。四、供体微球偶联亲和素1.供体微球混悬液处理：吸取一定量的供体微球于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量mes缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮，加入mes缓冲液调节供体微球浓度至100mg/ml。2.亲和素溶液配制：称量一定量亲和素(也可以是链霉亲和素或中和亲和素)，加mes缓冲液溶解至8mg/ml。3.混合：将处理好的供体微球混悬液、8mg/ml的亲和素以及mes缓冲液，以2:5:1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。4.反应：mes缓冲液配制25mg/ml的nabh3cn溶液，按照与反应液1:25的体积比加入，迅速混匀。37℃旋转反应48小时。5.封闭：mes缓冲液配制75mg/ml的gly溶液以及25mg/ml的nabh3cn溶液，按照与反应液2:1:10的体积比加入上述溶液中，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的bsa溶液(mes缓冲液)，其与反应液体积比为5:8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。6.清洗：向反应好的溶液中加入mes缓冲液，高速冷冻离心机离心，弃上清，加入新鲜mes缓冲液超声法重新悬浮，再次离心，如此清洗3次，最后用少量的缓冲液进行悬浮，测定固含量，用缓冲液调节浓度至10mg/ml。五、生物素标记抗体(第一试剂)的制备1.抗体处理：将anti-ctni抗体ⅱ透析于0.1mnahco3溶液，测定抗体浓度并调节至1mg/ml。2.用dmso配制16.17mg/ml的生物素溶液。3.标记：取处理好的1mg/mlanti-ctni抗体ⅱ与配制好的生物素溶液，二者按照10000:54的体积比进行混合，迅速混匀。2-8℃静置反应12-16小时。4.透析：将反应好的生物素标记抗体透析于生物素标记透析缓冲液(ph＝8.00)。5.将透析好的生物素化抗体吸出转移至干净离心管中，取样测定抗体浓度。将质检合格的生物素标记抗体浓度调节至0.5mg/ml。六、组装将上述制备的试剂进行组装，获得ctni均相化学发光检测试剂盒。实施例2：人心肌肌钙蛋白i均相化学发光检测方法在试剂杯条的待测样本孔位、附加试剂孔位、第一试剂孔位、第二试剂孔位分别加入25μl待检样本、25μl生物素标记的抗体、175μl供体试剂、25μl受体试剂后，将所述试剂杯条置于由博阳生物科技(上海)有限公司开发的poct分析仪中，加样机构取相应体积待测样本，加入到附加试剂孔位，振动，37℃温育10分钟；取附加试剂孔位内温育后的液体加入到第一试剂孔位后振动，37℃温育10分钟，形成混合液体；继续将混合液体加入到第二试剂孔位，振动，37℃温育10分钟，形成待测混合物。利用检测组件中的激发器发射的激光照射第二试剂孔位，经过一定时间反应，采用检测机构检测受体微球与活性氧反应所产生的化学发光信号，计算出待测样本中的待测目标分子的浓度。实施例3：人心肌肌钙蛋白i均相化学发光检测利用实施例1制备的试剂盒、实施例2所述方法检测人心肌肌钙蛋白i，检测结果如表1所示。表1从表1可知，在受体微球与供体微球粒径一定的情况下，当供体微球的粒径不小于所述受体微球的粒径时，检测的发光信号值较大，检测的灵敏度较好。实施例4：质控品与校准品的制备1.质控品的制备以新生牛血清为稀释液，将抗原纯品分别稀释为2个不同浓度的工作液，该工作液即为质控品q1、q2。取待检测的质控品q1、q2在本公司仪器系统上进行三次重复标定。每次测定10孔，并计算总体均值与sd，均值±3sd即为质控品浓度测定许可范围。2.校准品的制备抗原纯品用小牛血清(含防腐剂)稀释成系列浓度，用免疫测定用国家标准品校准后，冷冻保存备用。-20℃保存时，有效期2年。校准品与相应浓度的国家标准品同时进行分析测定，用4参数或其它模型拟合，要求校准品剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值应不低于0.9900；同时两条剂量-反应曲线不明显偏离平行(t检验)；以国家标准品为标准，校准品的实测效价与标定效价的比应在0.90-1.10之间。实施例5：ctni均相化学发光检测试剂盒的批间精密度的检测待测样本：实施例4中制备的质控品q1；过程：重复检测20次，得到光强度值(rlu)离群点的判定标准：≥3sd检测时采用的试剂：(1)受体试剂，其包括受体微球(受体微球的粒径为200nm，且分别与anti-pct抗体ⅰ连接；(2)第一试剂(生物素标记抗体，抗体为anti-pct抗体ⅱ)；(3)供体试剂，其包括供体微球(包被亲和素的不同粒径(80nm、200nm、300nm)的供体微球)。将试剂(1)-(3)进行搭配，组成如表2所示的试剂组1、试剂组2和试剂组3，分别检测ctni抗原(稀释到合适浓度后，试剂组1、2和3同时检测相同的样本)，重复检测20孔，检测过程如实施例2所述，检测结果如表3所示。表2：试剂分组试剂组1试剂组2试剂组3受体微球粒径/nm200200200供体微球粒径/nm80200300表3：从表3可知，相较于试剂组1，试剂组2和3的光强度增高，供体微球的粒径不小于受体微球的粒径时，该方法检测的光强度增高。同时相较于试剂组1，试剂组2和3的变异系数(cv)更小，即供体微球的粒径不小于受体微球的粒径时，精密性更高。实施例6：ctni均相化学发光检测试剂盒的分析灵敏度的检测待测样本：零值校准品；过程：重复检测20次，得到光强度值(rlu)灵敏度：rlu代入校准曲线检测时采用的试剂及检测过程同实施例5，检测结果如表4所示。表4：从表4可知，相较于试剂组1，试剂组2和3检测出的灵敏度更好，即供体微球的粒径不小于受体微球的粒径时，有利于提高试剂的灵敏度。对比例1：对比试剂盒的制备一、受体微球偶联抗体1、将anti-ctni抗体ⅰ透析至ph值＝10的50mmcb缓冲液，测得浓度为1mg/ml。2、在2ml离心管中加入0.5ml实施例1制备的受体微球，0.5mlanti-ctni抗体ⅰ，混匀后加入100μl10mg/mlnabh4溶液(50mmcb缓冲液)，2-8℃反应4小时。3、反应完毕后加入0.5ml100mg/mlbsa溶液(50mmcb缓冲液)，2-8℃反应2小时。4、反应完毕后离心45min，30000g，离心后弃去上清液，然后用50mmmes缓冲液重新悬浮。重复离心清洗4次，并稀释至终浓度为100μg/ml，获得粒径分别为100nm、150nm、200nm、250nm和350nm的包被anti-pct抗体ⅰ的受体微球。二、供体微球偶联抗体1、将anti-ctni抗体ⅱ透析至ph值＝10的50mmcb缓冲液，测得浓度为1mg/ml。2、在2ml离心管中加入0.5ml感光微球，0.5ml配对抗体ⅱ，混匀后加入100μl10mg/mlnabh4溶液(50mmcb缓冲液)，2-8℃反应4小时。3、反应完毕后加入0.5ml100mg/mlbsa溶液(50mmcb缓冲液)，2-8℃反应2小时。4、反应完毕后离心45min，30000g，离心后弃去上清液，用50mmmes缓冲液重新悬浮。重复离心清洗4次，并稀释至终浓度为100μg/ml。获得粒径分别为100nm、150nm、200nm、250nm和350nm的包被anti-ctni抗体ⅱ的供体微球。对比例2：对比试剂盒对人心肌肌钙蛋白i均相化学发光检测检测过程同实施例3，仅将使用的供体微球和受体微球替换为对比例1制备的对比供体微球和受体微球，检测结果如表5所示。表5从表5可知，对比试剂盒的发光信号量显著降低，检测灵敏度显著下降。且对比试剂盒中当供体微球不小于受体微球粒径的粒径时，检测的发光信号值也不较优。应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。当前第1页1 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