脱氧胆酸钠沉淀法检测Hib结合疫苗中游离多糖的方法与流程

本发明属于疫苗检测技术领域，特别涉及一种脱氧胆酸钠沉淀法检测hib结合疫苗中游离多糖的方法。

背景技术

流感嗜血杆菌是一类革兰氏阴性小杆菌，其可根据荚膜多糖组成和抗原性分为a、b、c、d、e、f型，b型流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzzaetypeb，hib)致病力最强，与大多数严重局部感染和侵袭性感染有关。

hib结合疫苗是利用纯化的hib荚膜多糖与破伤风类毒素共价结合而成的多糖蛋白结合物，该多糖蛋白结合物能够引起机体胸腺依赖性免疫应答，其成功研制为预防如脑膜炎、肺炎等侵袭性hib疾病提供了重要的工具。

在hib结合疫苗生产过程中，以hib荚膜多糖为主的游离多糖因其为t细胞非依赖性抗原，不但在再次免疫时不能使机体诱导免疫记忆应答，而且还会对hib结合疫苗的稳定性和效力造成影响，因此该游离多糖通常作为杂质而被去除，并在hib结合疫苗的原液和成品检测中将游离多糖含量的测定作为重要质量控制指标，以便于监控hib结合疫苗在生产过程中游离多糖的去除效果。

目前，测定游离多糖含量的方法较多，其中脱氧胆酸钠(sodiumdesoxycholate，doc)沉淀法具有操作简单、重现性好、结果可靠等优点而被广泛应用。其工作原理为：脱氧胆酸钠在酸性条件下形成胶团，能够将蛋白物质加以沉淀，进而达到hib结合疫苗中的多糖蛋白结合物与游离多糖分离的目的；最后再利用hib结合疫苗中的游离多糖在酸性条件下易水解生成核糖的特点，该游离多糖的含量通过检测其水解所得的核糖含量来测定。

然而，hib结合疫苗在结合原液制成成品的生产过程中还添加有蔗糖等赋形剂，以降低多糖蛋白结合物在冻干时被破坏的可能性，而蔗糖由一分子葡萄糖的半缩醛羟基与一分子果糖的半缩醛羟基彼此缩合脱水而成，其通过水解容易生成具有还原性的葡萄糖和果糖，进而对游离多糖的测定有较强的干扰，造成检测得到的游离多糖含量比实际高，从而导致hib结合疫苗在制备过程中为达到检测标准而花费更多的人力物力，使得其生产成本较高。因此，目前急需一种检测精确度高的用于检测hib结合疫苗中游离多糖的方法。

技术实现要素：

针对以上现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种高精确度的检测hib结合疫苗中游离多糖的方法，其中，本发明的发明人创造性的在进行脱氧胆酸钠处理前，先用超滤法去除蔗糖，以此减少hib结合疫苗中蔗糖的含量，再利用脱氧胆酸钠沉淀多糖蛋白结物，从而准确的对hib结合疫苗中的游离多糖含量加以测定，降低了hib结合疫苗的生产成本。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种脱氧胆酸钠沉淀法检测hib结合疫苗中游离多糖的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

一、供试品预处理：

①结合原液预处理：取适量原液用灭菌注射用水按标示量稀释，即得结合原液的供试品溶液；②成品预处理：取适量成品用灭菌注射用水按标示量溶解，取4.0ml于超滤离心管中，在温度为4℃、转速为7000-9000r/min的条件下超滤离心8-12min，收集浓缩液，补灭菌注射用水至总体积为4ml，重复8-10次上述在超滤离心后补灭菌注射用水的操作，吹打混匀后即得成品的供试品溶液；

二、游离多糖溶液的收集：量取步骤一中的结合原液或成品的供试品溶液，加入脱氧胆酸钠溶液，充分混匀后冰浴20-40min，再加入盐酸溶液，混匀后低温离心20-40min，收集上清液为游离多糖溶液；

三、核糖浓度的测定：使用化学法分别测定结合原液或成品的供试品溶液和游离多糖溶液中的核糖浓度，并将供试品溶液测得的核糖浓度记为c1，将游离多糖溶液测得的核糖浓度记为c2；

四、计算结合原液或成品中的多糖含量以及游离多糖的含量：

多糖含量(μg/ml)＝c1*n1/0.41

其中，n1为供试品的稀释倍数；0.41为核糖含量和多糖含量的换算系数；

游离多糖含量(％)＝(c2/c1)×n2×100％

其中，n2为供试品溶液经脱氧胆酸钠处理过程中被稀释的倍数。

根据本发明的一种实施方案，其中，步骤二中精密量取步骤一中的供试品溶液1.00ml，加入1％脱氧胆酸钠500μl，充分混匀后冰浴30min，再加入0.1mol/l盐酸溶液300μl，混匀后在温度为4℃、转速为8000-12000r/min的条件下离心30min，收集上清液为游离多糖溶液。

本发明通过结合原液和成品中游离多糖的测定，便于hib结合疫苗在生产过程中对游离多糖去除效果的监控。其中，在步骤一中使用灭菌注射用水稀释结合原液以及溶解成品，降低了供试品浓度的同时降低被其微生物感染的可能性，从而减少微生物对测定结果的影响。多糖结合蛋白在高温下容易发生变性而沉淀，在4℃、7000-9000r/min的条件下超滤离心能够有效除去蔗糖，同时减少多糖结合蛋白的沉淀。超滤过程中通常会在浓缩液中残留少量的蔗糖，重复若干次在超滤离心后补充灭菌注射用水的操作，能够对供试品中的蔗糖洗净，减少供试品溶液中干扰游离多糖测定的蔗糖量，使得测得供试品中的多糖物质为多糖蛋白结合物与游离多糖总和；

0.1mol/l的盐酸为脱氧胆酸钠提供一个酸性环境，使得脱氧胆酸钠在形成胶团状，多糖蛋白结合物与脱氧胆酸钠结合而形成沉淀物，在4℃、8000-12000r/min的条件下离心30min能够将沉淀的多糖蛋白结合物有效去除，使得上清液中的多糖物质仅为游离多糖，最后通过计算得出供试品中游离多糖的含量；

综上，本发明通过超滤和脱氧胆酸钠沉淀法减少了蔗糖和多糖蛋白结合物对游离多糖含量测定的影响，提高了对hib结合疫苗中游离多糖含量的检测精确度。

根据本发明的一种实施方案，其中，所述结合原液的供试品中的多糖蛋白结合物含量为60-100μg/ml。

hib结合疫苗生产过程中所得的结合原液中的多糖蛋白结合物浓度通常较高，将其稀释至60-100μg/ml，能够准确的对结合原液中的游离多糖含量加以测定。

根据本发明的一种实施方案，其中，所述成品为hib结合疫苗冻干剂，其规格为0.5ml/瓶，且每瓶中含纯化b型流感嗜血杆菌荚膜多糖不低于10μg。

药典对hib结合疫苗成品的标准规格为0.5ml/瓶，且每瓶中含纯化b型流感嗜血杆菌荚膜多糖不低于10μg，以此通过对合格的hib结合疫苗加以测定，能够减少不合格品检测所造成的试剂的浪费。

根据本发明的一种实施方案，其中，步骤三中的化学法为地衣酚法，包括如下操作步骤：

a、量取1.0ml灭菌注射用水，依次加入三氯化铁盐酸溶液和地衣酚乙醇溶液，充分混匀后得到空白对照液；

b、量取若干份1.0ml不同浓度的核糖标准溶液，依次加入三氯化铁盐酸溶液和地衣酚乙醇溶液，充分混匀后得到标准对照液；

c、将供试品溶液或游离多糖溶液稀释至核糖浓度低于25μg/ml，作为样品溶液，随后量取1.0ml该样品溶液，依次加入三氯化铁盐酸溶液和地衣酚乙醇溶液，充分混匀后得到样品测定液；

d、将步骤a中的空白对照液、步骤b中的标准对照液和步骤c中的样品测定液均先置于沸水中水浴4-6min，再置于冰水中水浴25-35min，随后用冰水浴后的空白对照液作校准，测定各组标准对照液和样品测定液在波长670nm处的吸光度；

e、利用步骤d中各组标准对照液测得的吸光度制作以核糖标准溶液的浓度对核糖标准溶液相应的吸光度作回归直线方程；

f、将步骤d中样品测定液测得的吸光度代入回归直线方程中得到对应的c1或c2。

根据本发明的一种实施方案，其中，所述三氯化铁盐酸溶液的质量分数为0.1％，其添加量为5ml；所述地衣酚乙醇溶液的质量分数为0.1％，其添加量为0.4ml。

根据本发明的一种实施方案，其中，步骤b中不同浓度的核糖标准溶液由浓度为25μg/ml的d-核糖标准溶液配置而成，其配置方法为依次量取0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml的d-核糖标准溶液，随后对应加入0.90ml、0.80ml、0.60ml、0.40ml、0.20ml、0.00ml的灭菌注射用水，充分混匀即得。

空白对照液在标准对照液检测过程中用于校准仪器，使得标准对照液测得的吸光度更为精确；另外，标准对照液由多个等浓度梯度的核糖稀释溶液配置而成，从而使得回归直线方程能够具有更好的代表性，从而将供试品溶液和游离多糖溶液测定的浓度带入回归直线方程中时能得到精确度较高的核糖浓度，减小因不同实验人员检测所带来的操作误差。

根据本发明的一种实施方案，其中，步骤一中的成品在溶解时添加有o/w型微乳液。

根据本发明的一种实施方案，其中，所述o/w型微乳液按质量份数计，由4-6份的异辛烷、4-6份的聚乙二醇辛基苯基醚、4-6份的正丁醇和80-90份的灭菌注射用水组成。

根据本发明的一种实施方案，其中，所述o/w型微乳液按质量份数计，由5份的异辛烷、5份的聚乙二醇辛基苯基醚、5份的正丁醇和85份的灭菌注射用水组成。

供试品在溶解过程中，会有少量的蔗糖发生水解反应，o/w型微乳液主要由油、水、表面活性剂和助表面活性剂组成，其与能将蔗糖包覆在微乳液液滴中，减少了蔗糖与灭菌注射用水的接触，进而抑制蔗糖的水解。

上述油可以为庚烷、异辛烷、壬烷等中的一种或多种混合物，本发明中优先为异辛烷。上述表面活性剂可以为聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵等中的一种或多种的混合液，本发明中优选为聚乙二醇辛基苯基醚。上述表面活性剂助剂可以为正丁醇、2-戊醇、2-甲基-2-丁醇等中的一种或多种的混合物，本发明中优选为正丁醇。

其中，聚乙二醇辛基苯基醚分子中含有氧乙烯基，能够与蔗糖分子结构中的羟基通过分子间的氢键作用相结合，正丁醇使得聚乙二醇辛基苯基醚胶束栅栏层的极性基团的极性降低，从而使得较多的蔗糖进入o/w型微乳液液滴中，进而使得蔗糖的水解反应得到抑制，最后再结合超滤离心，能够快速有效的将蔗糖以及o/w型微乳液一步去除，以此提高蔗糖的去除效率。

此外，聚乙二醇辛基苯基醚还能够加快供试品中的多糖蛋白结合物快速的分散于灭菌注射用水中，同时降低多糖蛋白结合物在超滤过程中发生沉淀的可能性，从而提高对hib结合疫苗中多糖含量测定的精确度。

另外，经研究实验证明，在超滤过程中添加本发明设定的微乳液还能增加游离多糖的稳定性，有助于进一步提高游离多糖含量测定的精确度。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的脱氧胆酸钠沉淀法检测hib结合疫苗中游离多糖的方法具有结合原液和成品同测、检测精确度高、操作简便的优点，能够节省hib结合疫苗在制备过程中为达到检测标准而花费的人力物力，从而降低hib结合疫苗的生产成本。

附图说明

图1为脱氧胆酸钠沉淀法检测hib结合疫苗中游离多糖的方法的操作步骤。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

1、检测使用设备及物料

1.1、用具：移液枪(规格为1-5ml、100～1000μl、20～200μl)购自德国埃本德公司；

1.2、仪器和设备：biofugeprimor台式离心机购自美国thermo公司；tu-1810紫外分光光度计购自北京析普公司；

1.3、物料：本发明所涉及的化学试剂除了脱氧胆酸钠、d-核糖和地衣酚均购自sigma公司产品，其他试剂均为国产分析纯。

2、物料的配置

2.1、质量分数为1％脱氧胆酸钠溶液：称取脱氧胆酸钠1g，加灭菌注射用水，定容至100ml；

2.2、浓度为0.1mol/l的盐酸溶液：量取8.3ml的质量分数为36％的浓盐酸，加灭菌注射用水，定容至1000ml；

2.3、质量分数为0.1％的三氯化铁盐酸溶液：称取三氯化铁(fecl3·6h2o)0.1g，加质量分数为36％的浓盐酸，定容至100ml；

2.4、质量分数为0.1％的地衣酚(3，5-2甲基间苯二酚)乙醇溶液：称取地衣酚1g，加质量分数为95％的乙醇，定容至10ml；

2.5、浓度为25μg/ml的d-核糖标准溶液：称取d-核糖1.25g，加灭菌注射用水，定容至50ml。

3、一种脱氧胆酸钠沉淀法检测hib结合疫苗中游离多糖的方法，参见图1，包括以下操作步骤：

一、供试品预处理

①、结合原液的预处理：量取适量hib结合疫苗的结合原液，用灭菌注射用水稀释结合原液至其多糖蛋白结合物浓度为60-100μg/ml，吹打混匀，即得结合原液的供试品溶液；

②、成品的预处理：取36瓶规格为0.5ml/瓶、每瓶中纯化b型流感嗜血杆菌荚膜多糖含量不低于10μg的hib结合疫苗的成品，加入9ml灭菌注射用水复溶，取2份4.0ml复溶的成品于超滤离心管中，在温度为4℃、转速为7000-9000r/min的条件下超滤离心8-12min，收集浓缩液，补灭菌注射用水至总体积为4ml，重复9次上述在超滤离心后补灭菌注射用水的操作，最后一次补灭菌注射用水至4ml后吹打混匀，即得成品的供试品溶液；

二、游离多糖溶液的收集

精密量取步骤一中的供试品溶液1.00ml，加入1％脱氧胆酸钠500μl，充分混匀后冰浴30min，再加入0.1mol/l盐酸溶液300μl，混匀后在温度为4℃、转速为8000-12000r/min的条件下离心20-40min，收集上清液为游离多糖溶液；

三、核糖浓度的测定：

a、空白对照液配制：精密量取1.0ml灭菌注射用水，依次加入5ml质量分数为0.1％的三氯化铁盐酸溶液，混匀，再加入0.4ml质量分数为0.1％的地衣酚乙醇溶液，充分混匀后得到空白对照液；

b、标准对照液配制：依次精密量取0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml的浓度为25μg/ml的d-核糖标准溶液，随后对应加入0.90ml、0.80ml、0.60ml、0.40ml、0.20ml、0.00ml的灭菌注射用水，得到6份不同浓度的核糖标准溶液，分别从该6份核糖标准溶液中精密量取1.0ml，依次加入5ml质量分数为0.1％的三氯化铁盐酸溶液，混匀，再加入0.4ml质量分数为0.1％的地衣酚乙醇溶液，充分混匀后得到6份不同d-核糖浓度的标准对照液；

c、样品测定液配制：将供试品溶液或游离多糖溶液稀释至核糖浓度低于25μg/ml，作为样品溶液，随后量取1.0ml该样品溶液，依次加入5ml质量分数为0.1％的三氯化铁盐酸溶液，混匀，再加入0.4ml质量分数为0.1％的地衣酚乙醇溶液，充分混匀后得到样品测定液；

d、吸光度测定：将步骤a中的空白对照液、步骤b中的标准对照液和步骤c中的样品测定液均先置于沸水中水浴4-6min，再置于冰水中水浴25-35min，随后用冰水浴后的空白对照液作校准，测定各组标准对照液和样品测定液在波长670nm处的吸光度；

e、回归直线方程建立：利用步骤d中各组标准对照液测得的吸光度制作以核糖标准溶液的浓度对核糖标准溶液相应的吸光度作回归直线方程；

f、核糖浓度计算：将步骤d中样品测定液测得的吸光度代入回归直线方程中，供试品溶液测得的核糖浓度记为c1，游离多糖溶液测得的核糖浓度记为c2；

四、计算供试品中多糖含量以及游离多糖的含量：

多糖含量(μg/ml)＝c1*n1/0.41

其中，n1为供试品的稀释倍数；0.41为核糖含量和多糖含量的换算系数；

游离多糖含量(％)＝(c2/c1)×1.8×100％

其中，1.8为供试品溶液经脱氧胆酸钠处理过程中被稀释的倍数。

4、实施例

4.1、实施例1-实施例7

实施例1-实施例7均在上述检测方法的基础上，对步骤中的参数作出调整，具体调整情况如下表所示。

4.2、实施例8-实施例12

实施例8-实施例12均在实施例1的方法基础上，在步骤一中的供试品在溶解时添加有1ml的o/w型微乳液，且实施例8-实施例12添加的o/w型微乳液质量份数计，包括4-6份的异辛烷、4-6份的聚乙二醇辛基苯基醚、4-6份的正丁醇和80-90份的灭菌注射用水，其具体各组分的配比参见下表。

4.3、对比例1

与实施例1的区别之处在于，本对比例的步骤一中供试品预处理为：

①、结合原液的预处理：量取适量hib结合疫苗的结合原液，用灭菌注射用水稀释结合原液至其多糖蛋白结合物浓度为60-100μg/ml，吹打混匀，即得结合原液的供试品溶液；

②、成品的预处理：取36瓶规格为0.5ml/瓶、每瓶中纯化b型流感嗜血杆菌荚膜多糖含量不低于10μg的hib结合疫苗的成品，加入9ml灭菌注射用水复溶，吹打混匀，即得成品的供试品溶液。

5、各实施例以及对比例的检测性能比较

5.1、多糖含量和游离多糖含量测定

选取同一生产批号的hib结合疫苗的结合原液和成品分别作为供试品，将该两种供试品依次按照实施例1至实施例7以及对比例1中的检测方法进行检测，检测结果如下表所示。

注：检测所得的多糖含量中包含游离多糖的含量，而游离多糖含量去除量为hib结合疫苗在产生过程中游离多糖实际去除的含量。

5.2、蔗糖去除效果的检测

将实施例8-实施例12中的供试品溶液作为检测样品，实施例1中的供试品溶液作为对照样品，对比例1中的供试品溶液作为空白样品。

用浓度为3.5μmol/l的芘作荧光探针，使用日本岛津公司出售的pf-540荧光分光光度计，在25±0.1℃、激发波长338nm的条件下，测定芘在上述检测样品、对照样品和空白样品中的稳定荧光光谱，设定芘在第一发射峰(373nm)和第三发射峰(384nm)附近的荧光强度的比值(i1/i3)，即为芘所处微环境极性的大小。

由于蔗糖在聚乙二醇辛基苯基醚胶束栅栏层中位于正丁醇和芘之间，使得芘向聚乙二醇辛基苯基醚胶束栅栏层内侧移动，且蔗糖浓度越高，芘移动的程度越大，测定的芘所处微环境的极性也就越小。

具体检测结果如下表：

5.3、检测结果分析

将实施例1至实施例7和对比例1进行检测结果比较，在结合原液检测数据维持稳定的条件下，成品通过实施例1至实施例7中任何一个测试方法所测得的多糖含量更接近其结合原液中的多糖含量，游离多糖含量则相对降低，游离多糖去除量相对增高；

此外，芘在结合原液或成品所形成的微环境中，通过实施例1至实施例7中任何一个供试品预处理方式所测得的极性大于通过对比例1所测得的极性；

进而可以得到，通过本发明所提供的检测方法对成品进行超滤离心，能够有效将bib结合疫苗中的蔗糖去除，减少蔗糖对游离多糖含量测得的影响，从而提高检测hib结合疫苗中的游离多糖含量的精确度，同时使得该hib结合疫苗生产时实际需要去除的游离多糖含量降低，以此减少了hib结合疫苗为达到检测标准而花费的生产成本。

将实施例8至实施例12和实施例1、对比例1进行检测结果比较，可以得到，在结合原液检测数据维持稳定的条件下，成品通过实施例8至实施例12中任何一个测试方法所测得的多糖含量比实施例1以及对比例1更接近其结合原液中的多糖含量，游离多糖含量则相对降低，游离多糖去除量相对增高；

此外，芘在结合原液或成品所形成的微环境中，通过实施例8至实施例12中任何一个供试品预处理方式所测得的极性大于通过对比例1所测得的极性；

进而可以得到，在hib结合疫苗供试品溶解时添加o/w型微乳液，能够进一步增加hib结合疫苗中蔗糖的去除效果，同时使得该hib结合疫苗生产时实际需要去除的游离多糖含量降低，以此进一步减少了hib结合疫苗为达到检测标准而花费的生产成本；且当o/w型微乳液中异辛烷、聚乙二醇辛基苯基醚、正丁醇和灭菌注射用水的配比为5：5：5：85时蔗糖去除效果达到最佳；

另外，添加o/w型微乳液能够使得多糖蛋白结合物快速均匀的分散于灭菌注射用水中，降低多糖蛋白结合物在超滤过程中发生沉淀的可能性，以此能够进一步提高检测hib结合疫苗中的多糖含量以及游离多糖含量的精确度。

6、专属性检测

专属性检测是利用已知游离多糖含量的结合原液和成品作为检测样品，且确定该检测样品中无蔗糖，使用本发明再次测定该检测样品中的游离多糖含量，随后通过比较采用本发明测得的游离多糖含量和实际的游离多糖含量，计算回收率(％)＝(本发明测得的游离多糖含量/实际的游离多糖含量)*100％，其中回收率与100％越接近，则表示本发明对游离多糖含量测定的准确性越高，从而判定本发明的专属性能。

其具体操作为：取3份游离多糖实际含量分别为17.65％、18.21％、18.52％的结合原液以及3份游离多糖实际含量分别16.82％、17.27％、18.13％的成品，将其分别采用实施例1和实施例10的检测方法测定其游离多糖的含量，计算回收率，检测结果如下表所示。

由上表可得，使用本发明检测游离多糖的回收率稳定在97.8-101.1％之间，符合标准的要求，从而证明发明具有良好的专属性，能够精确的测定游离多糖的含量；此外，添加有o/w型微乳液检测方法其回收率稳定在99.4-100.1％，从而能够增加游离多糖的稳定性，有助于进一步提高游离多糖含量测定的精确度。

7、最低检测限检测

最低检测限检测是利用已知游离多糖含量的结合原液和成品作为检测样品，且确定该检测样品中无蔗糖，使用本发明再次测定该检测样品中的游离多糖含量，随后通过比较采用本发明测得的游离多糖含量和实际的游离多糖含量，计算回收率(％)＝(本发明测得的游离多糖含量/实际的游离多糖含量)*100％，其中回收率与100％越接近，则表示本发明对游离多糖含量测定的准确性越高，从而确定本发明检出游离多糖的最低浓度。

其具体操作为：取6份游离多糖实际含量分别为1.02μg/ml、1.75μg/ml、2.56μg/ml、3.74μg/ml、5.26μg/ml的结合原液以及6份游离多糖实际含量分别0.98μg/ml、1.22μg/ml、1.95μg/ml、2.37μg/ml、3.96μg/ml的成品，将其分别采用实施例1和实施例10的检测方法测定其游离多糖的含量，计算回收率，检测结果如下表所示。

由上表可得，使用本发明检测hib结合蛋白中的游离多糖时，游离多糖的回收率符合标准的要求。其中，使用本发明检测结合原液中的游离多糖含量时的最低检测限为1.75μg/ml，其游离多糖的回收率稳定在93.1-104.3％；使用本发明检测结合原液中的游离多糖含量时的最低检测限为1.22μg/ml，其回收率稳定在94.3-102.5％；此外，本发明在稀释结合原液或溶解成品时添加o/w型微乳液能够有效提高游离多糖的回收率。

综上，本发明提供的检测hib结合疫苗中游离多糖的方法具有较高的检测精确度，能够准确的对hib结合疫苗中的游离多糖含量加以测定，降低了hib结合疫苗的生产成本。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。